丹参全基因组DNA甲基化谱及DNA甲基转移酶与去甲基化酶基因的系统分析

发布时间：2022-04-23 14:44

　　作为重要的表观遗传标记,DNA甲基化涉及生物体内的多种分子机制,参与植物的基因印记、生长发育、胁迫应答、次生代谢等生物学过程。由于DNA甲基化研究在模式植物和作物中取得的重要进展,科研人员逐渐意识到药用植物品质的形成必然也受到DNA甲基化的调控,然而DNA甲基化在其中所扮演的具体作用和调控的分子机制还不清楚。丹参具有药用活性成分清楚、世代周期短、组织培养简单、遗传转化体系成熟等优点,是药用植物遗传学和表观遗传学研究的理想材料。本研究分析了 3月份和7月份两个时期的丹参根以及7月份的根和叶中的DNA甲基化差异,结合DNA甲基转移酶家族基因和去甲基化酶家族基因的系统分析,探讨DNA甲基化在丹参中的生物学功能,为深入理解DNA甲基化在丹参生长发育、次生代谢、胁迫响应等生物学过程中的作用奠定基础,进而为丹参等药用植物的栽培、分子育种提供理论指导。获得了以下主要结果:1.利用亚硫酸盐测序的方法对丹参3月份的根以及7月份的根和叶进行了单碱基分辨率甲基组解析,研究表明组织间甲基化的差异主要出现在基因的启动子区和重复序列区。甲基化胞嘧啶主要来自于CHH背景,鉴定到的差异甲基化位点（DMS）和差异甲基化... 

【文章页数】：151 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
第一章 文献综述
    1 丹参研究进展
        1.1 丹参概述
            1.1.1 丹参植物形态
            1.1.2 丹参化学成分
            1.1.3 丹参药理作用
        1.2 丹参分子生物学研究进展
            1.2.1 丹参组学研究进展
            1.2.2 丹参基因家族研究进展
            1.2.3 丹参基因功能验证
    2 表观遗传与表观调控
    3 DNA甲基化
        3.1 DNA甲基化模式
        3.2 从头甲基化
        3.3 DNA甲基化的维持
        3.4 DNA甲基化的去除
        3.5 DNA甲基化的分析技术
            3.5.1 特定位点的甲基化检测技术
            3.5.2 基因组范围的甲基化检测技术
        3.6 DNA甲基化的生物学功能
        3.7 DNA甲基转移酶与去甲基化酶
        3.8 药用植物DNA甲基化的研究进展
    4 CRSPR/Cas9基因组编辑系统
        4.1 基因组编辑技术概述
        4.2 CRISPR/Cas9的技术原理
        4.3 CRISPR/Cas9在植物基因组编辑中的应用
        4.4 CRISPR/Cas9基因打靶的检测方法
    5 本研究的目的和意义
    6 参考文献
第二章 丹参全基因组范围的DNA甲基化谱
    1 实验材料
    2 实验方法
        2.1 基因组DNA提取
        2.2 亚硫酸盐测序文库的构建和质检
        2.3 上机测序
    3 DNA甲基化测序数据分析
        3.1 测序reads的质控
        3.2 序列比对和甲基化位点的提取
        3.3 甲基化水平分析
        3.4 DMR相关基因的功能注释
        3.5 5Aza-dC处理丹参毛状根和HPLC分析
    4 结果
        4.1 丹参组织间的DNA甲基化比较分析
        4.2 基因和重复区域的DNA甲基化模式
        4.3 DNA甲基化差异分析
        4.4 DMR相关基因的GO功能分析
        4.5 DMR相关基因的KEGG富集分析
        4.6 DNA甲基化参与丹参酮的生物合成
    5 讨论
    6 参考文献
第三章 丹参SMC5-MTASE基因的鉴定和分析
    1 实验材料
    2 实验方法
        2.1 SmC5-MTase基因鉴定
        2.2 基因结构检测,蛋白序列分析和进化树构建
        2.3 丹参RNA的提取
        2.4 cDNA的合成
        2.5 荧光定量PCR引物设计
        2.6 荧光定量PCR
        2.7 RNA-seq数据和生物信息学分析
    3 结果
        3.1 SmC5-MTase基因的鉴定和序列特征
        3.2 序列比对和保守基序
        3.3 丹参和其它植物中C5-MTase的进化分析
        3.4 丹参C5-MTase基因家族的组织特异性表达
        3.5 SmC5-MTse对酵母提取物和茉莉酸甲酯的响应
        3.6 水杨酸响应SmC5-MTase
    4 讨论
    5 参考文献
第四章 丹参DML基因的鉴定和分析
    1 实验材料
    2 实验方法
        2.1 SmDML基因鉴定
        2.2 基因结构和蛋白序列分析
        2.3 进化分析
        2.4 RNA提取
        2.5 cDNA合成
        2.6 SmDML荧光定量PCR引物设计
        2.7 荧光定量PCR
        2.8 microRNA提取
        2.9 microRNA的反转录和表达分析
        2.10 RNA-Seq数据和生物信息学分析
        2.11 潜在靶向SmDML基因的miRNA鉴定
        2.12 miR7972介导的切割验证
        2.13 唇形亚纲MIR7972基因的鉴定
    3 实验结果
        3.1 SmDML的鉴定和比较分析
        3.2 DML的保守结构域和基序
        3.3 DML蛋白的进化分析
        3.4 SmDML的差异表达
        3.5 SmDML基因响应5Aza-dC的表达模式
        3.6 miRNA介导的SmDML1的转录后调控
        3.7 MIR7972基因的进化
    4 讨论
    5 参考文献
第五章 利用CRISPR/CAS9系统定点敲除SMMET1和SMDML3基因的研究
    1 实验材料
        1.1 菌株与载体
        1.2 各种生化试剂与酶
    2 实验方法
        2.1 引物设计
        2.2 PCR扩增和电泳切胶回收
        2.3 CRISPR/Cas9载体的构建
        2.4 阳性克隆鉴定
        2.5 转化GV3101农杆菌感受态细胞
        2.6 转化丹参
        2.7 获得再生丹参苗
        2.8 筛选鉴定突变植株
    3 结果
        3.1 打靶基因的确定
        3.2 靶点的选择
        3.3 含有两个sgRNA表达框的双元载体的构建
        3.4 双元载体转化GV3101农杆菌感受态
        3.5 突变类型的鉴定
    4 讨论
    5 参考文献
第六章 结论与展望
    1 结论
    2 展望
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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[3]川牛膝道地性形成的表观遗传机制的初步研究[D]. 文静.成都中医药大学 2016
[4]麦冬类植物遗传变异的分子标记研究和表观遗传初探[D]. 徐护朝.华侨大学 2014
[5]四倍体长春花（Catharanthus roseus）生物学特性研究及DNA甲基化分析[D]. 朱恒星.西南大学 2009



本文编号：3647390