鸭源鸡杆菌中国株外膜蛋白W基因鉴定及其敲除株的构建

发布时间：2022-05-12 18:54

　　鸭源鸡杆菌是巴氏杆菌科鸡杆菌属的代表种,为革兰氏阴性菌。研究表明其在一定条件下能够引起蛋鸡生殖系统的损伤、腹膜炎及败血症和呼吸道疾病等,造成产蛋量下降,死亡率上升。鸭源鸡杆菌存在多重耐药性及固有抗原的多样性,这使得抗生素及疫苗对该病的防治效果不甚理想,给养殖业带来的经济损失越来越严重。目前,鸭源鸡杆菌致病机理的研究还十分有限,仅有少数几个预测的毒力因子得到的确认,其中包括新型的RTX毒素Gtx A、多糖荚膜、金属蛋白酶和粘附素等。本试验首次针对鸭源鸡杆菌外膜蛋白W（OmpW）开展了初步研究,首先借助PCR及生物信息学方法,获得了OmpW基因在鸭源鸡杆菌中分布状态、预测了其可能存在的抗原表位,并利用鸭源鸡杆菌OmpW的原核表达产物制备多克隆抗体,对其免疫原性进行了研究。为进一步的研究OmpW基因的功能,本试验首次在国内利用靶向基因操作技术成功构建了鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因突变株Δomp W。1.鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因扩增及生物信息学分析本研究参照GenBank中公布的UMN179的OmpW基因序列,设计一对通用引物,通过PCR对32株不同来源的鸭源鸡杆菌OmpW基因进行扩增,首次对鸭源... 

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
英文缩写词表
摘要
文献综述
    1 鸡杆菌概述
        1.1 鸡杆菌分类地位的确立
        1.2 鸡杆菌的致病性
        1.3 鸭源鸡杆菌主要毒力因子
    2 外膜蛋白
        2.1 外膜蛋白概述
        2.2 外膜蛋白W（Outer membrane protein W, OmpW）
    3 基因功能研究方法
        3.1 基因生物信息学分析
        3.2 基因的表达谱分析
        3.3 蛋白相互作用研究
        3.4 基因功能的实验学验证
    4 基因敲除(Gene knock)技术
        4.1 随机插入突变法
        4.2 基因重组技术
        4.3 RNA干扰
    5 基因敲除技术在鸭源鸡杆菌中的应用
    6 小结
试验研究
    试验一 鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因克隆及生物信息学分析
        引言
        1 材料与方法
            1.1 菌株
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器设备
            1.4 引物设计与合成
            1.5 细菌的培养
            1.6 OmpW基因的扩增及测序
            1.7 OmpW核苷酸及编码氨基酸序列分析
            1.8 OmpW理化性质分析
            1.9 OmpW信号肽及结构分析
            1.10 OmpW B细胞抗原表位预测
        2 结果与分析
            2.1 OmpW基因的PCR扩增
            2.2 OmpW核苷酸序列分析
            2.3 OmpW氨基酸同源性分析
            2.4 OmpW的理化性质
            2.5 OmpW信号肽及结构分析
            2.6 OmpW线性B细胞抗原表位预测
        3 讨论
    试验二 鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因的表达及抗原性鉴定
        前言
        1 材料和方法
            1.1 菌株和质粒
            1.2 酶及主要试剂
            1.3 主要仪器设备
            1.4 引物设计及合成
            1.5 细菌基因组DNA的制备
            1.6 OmpW基因的扩增
            1.7 重组表达质粒的构建及鉴定
            1.8 重组菌的诱导表达
            1.9 OmpW蛋白的纯化和Western blot鉴定
            1.10 多克隆抗体的制备及鉴定
        2 结果与分析
            2.1 OmpW基因的扩增
            2.2 重组表达质粒的鉴定
            2.3 表达产物的SDS-PAGE分析
            2.4 原核表达OmpW Western blotting鉴定
            2.5 OmpW免疫原性分析
        3 讨论
    试验三 鸭源鸡杆菌OmpW基因敲除株的构建
        引言
        1 菌株与材料
            1.1 菌株与质粒
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器设备
            1.4 主要培养基的配制
        2 方法
            2.1 国内菌株自然感受基因的检测
            2.2 鸭源鸡杆菌ΔOmpW突变株的构建
        3 结果与分析
            3.1 鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG基因组含有自然感受基因
            3.2 主要自然感受相关基因测定
            3.3 OmpW基因上下游同源臂及CMP抗性盒子的扩增
            3.4 pUC18-S-C-X质粒的酶切鉴定
            3.5 鸭源鸡杆菌突变株的鉴定
        4 讨论
全文总结
参考文献
附:作者读研期间发表文章
ABSTRACT


【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭源鸡杆菌致病力与生物被膜形成能力及耐药性的相关性分析研究[J]. 张秀平,陈陆,赵军,王川庆,王新卫,常洪涛,刘红英,卢彩景,杨霞.  中国兽医学报. 2014(10)
[2]大肠杆菌外膜蛋白ompW基因敲除菌的构建及其对两种抗生素的敏感性[J]. 吴贤斌,邹海杰,田丽花,潘建义,赵辅昆.  微生物学报. 2012(08)
[3]我国部分地区蛋鸡群鸭源鸡杆菌血清流行病学调查[J]. 王珊,陈陆,付仁一,杨霞,赵军,高冬生,李乔晶,姚惠霞,王川庆.  中国预防兽医学报. 2011(02)
[4]基因敲除技术及其在微生物育种中的应用[J]. 张红岩,申乃坤,周兴.  酿酒科技. 2010(04)
[5]45株鸡卡氏杆菌的分离鉴定[J]. 郑鹿平,杨霞,陈陆,皇甫和平,刘慧敏,郭伦涛,徐雪,付仁一,王泽霖,王川庆.  中国兽医学报. 2010(03)
[6]基于Red同源重组和高效自杀性载体系统构建肠炎沙门氏菌突变株方法的比较[J]. 朱春红,孙晓庆,何素芬,朱国强.  中国预防兽医学报. 2009(02)
[7]蛋鸡群卡氏杆菌感染情况的初步研究[J]. 王川庆,陈陆,杨霞,皇甫和平,刘红英,彭志峰,郑鹿平,徐雪,刘惠敏,付仁一,郭轮涛.  河南农业科学. 2008(03)
[8]一种新的基因敲除术-RNAi[J]. 李颖平,张映,邵国青.  生物技术通报. 2006(03)
[9]植物功能基因组研究中的基因敲除技术[J]. 陈其军,肖玉梅,王学臣,周海梦.  植物生理学通讯. 2004(01)
[10]细菌耐药机制与临床治疗对策[J]. 王睿,柴栋.  国外医药(抗生素分册). 2003(03)

硕士论文
[1]铁离子调节革兰氏阴性菌外膜蛋白OmpW抗宿主氧化应激作用及机制的研究[D]. 邹海杰.浙江理工大学 2012
[2]61株鸭源鸡杆菌部分耐药基因及其与耐药性关系的研究[D]. 高冬生.河南农业大学 2011
[3]鸡杆菌地方分离株耐药性及耐药基因的研究[D]. 郭伦涛.河南农业大学 2010



本文编号：3652818