乳杆菌bsh基因的高效表达及高活性酶蛋白获得

发布时间：2022-07-11 12:03

　　目的探讨乳杆菌bsh基因的高效表达及胆盐水解酶（BSH）的高活性酶蛋白获得。方法从本实验室保存的12株乳杆菌菌株中,通过Ca²⁺沉淀法初筛获得具BSH活性的菌株,根据GenBank上公布的16S rRNA同源性最高的乳杆菌的BSH全基因序列,设计特异性引物,PCR扩增获得bsh基因并克隆至表达载体pET-28α,构建BL21-pET-28α-bsh原核表达体系。经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE分析及Western blot验证。结果研究表明在分子质量大小约35、37 kD处有预期条带出现,初步表明BSH蛋白表达成功。进而对表达各条件进行优化,最佳酶活条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导pH 6.5、诱导温度37℃、诱导时间1 h。经镍柱亲和层析纯化制备BSH制剂,邻苯三酚红钼法蛋白浓度测定为1 446 mg/dL,茚三酮法测酶活性最高可达21 248.27 U/（g·prot）,为纯化前的635.4倍。结论乳杆菌bsh基因可溶性表达成功且高酶活BSH纯化获取为进一步的研究和药物转化奠定基础。 

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株及质粒
        1.1.2 主要试剂与仪器设备
        1.1.3 培养基
    1.2 方法
        1.2.1 具有胆盐水解酶的乳杆菌菌株
        1.2.2 不同菌株对胆固醇去除率的测定
        1.2.3 乳杆菌总DNA的提取
        1.2.4 16S rRNA鉴定乳杆菌菌种
        1.2.5 不同乳杆菌bsh基因的扩增
        1.2.6 bsh基因的克隆与转化子验证
        1.2.7 bsh基因原核表达体系的构建
        1.2.8 BSH蛋白的诱导表达
        1.2.9 重组蛋白的Western blot验证
        1.2.10 原核表达条件的优化
        1.2.11 镍柱亲和层析纯化BSH及SDS-PAGE检测
        1.2.12 茚三酮法测定BSH纯酶制剂酶活性单位
    1.3 统计方法
2 结 果
    2.1 MRS-THIO-OX培养基中产BSH菌株筛选
    2.2 不同乳杆菌的BSH酶对胆固醇去除效果比较
    2.3 16S rRNA乳杆菌鉴定
    2.4 bsh基因的扩增
    2.5 重组蛋白BSH的SDS-PAGE鉴定
    2.6 重组蛋白的Western blot分析
    2.7 BSH蛋白表达条件的优化
    2.8 BSH 酶活的再次验证
    2.9 BSH酶制剂的纯化与SDS-PAGE分析
    2.10 BSH酶活性单位测定(茚三酮法)
3 讨 论
    3.1 结果分析
    3.2 研究的意义


【参考文献】：
期刊论文
[1]双歧杆菌胆盐水解酶基因的重组表达、纯化与酶学性质[J]. 周晓玲,张娟,陈坚,堵国成.  食品与生物技术学报. 2016(08)
[2]胆盐水解酶基因结构与功能研究现状[J]. 黄艳娜,任婧.  乳业科学与技术. 2015(02)
[3]乳酸菌降胆固醇作用研究进展[J]. 廖宇欣,钱丽丽,于长青.  农产品加工(学刊). 2013(08)



本文编号：3658130