玉米肌醇半乳糖苷合成酶2基因（ZmGOLS2）的功能和表达调控研究

发布时间：2022-07-13 09:40

　　玉米（Zea mays L.）作为全世界重要的粮食作物,在其整个生长周期中受到各种非生物逆境胁迫（干旱,热和盐等等）的侵扰,尤其在开花期前后出现的不良环境对产量的影响最大。棉子糖是植物体内重要的糖类物质,其在植物细胞中的含量直接影响植物对逆境的抵抗能力与种子活力。通过调控棉子糖代谢途径提高玉米抗逆性与种子活力是玉米生物技术育种的一个新思路,至今仍是空白。肌醇半乳糖苷合成酶（Galactinol synthase,GOLS）是棉子糖生物合成起始的关键限速酶。早期研究发现玉米肌醇半乳糖苷合成酶（ZmGOLS）基因家族的两个成员（ZmGOLS1和ZmGOLS2）在玉米萌发种子和愈伤中受干旱和热激胁迫诱导表达,并且在ZmGOLS2的启动子上存在一个响应热激的顺式作用元件（HSE）。但是肌醇半乳糖苷合成酶在植物抗逆中所起的作用及其表达调控仍然未知。本研究发现了在干旱和热激胁迫下调控ZmGOLS2的转录因子,研究了超表达ZmGOLS2植株的抗逆分子机制。同时通过不同玉米自交系授粉后35 d种胚中肌醇半乳糖苷含量,ZmGOLS2 mRNA表达量和ZmGOLS2蛋白含量与包含368个玉米自交系转录组S... 

【文章页数】：147 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
    1.1 植物响应非生物逆境胁迫研究进展
    1.2 棉子糖家族寡糖(Raffinosefamilyoligosaccharides,RFOs)在非生物逆境胁迫中的作用
        1.2.1 肌醇半乳糖苷合成酶(GOLS)与肌醇半乳糖苷(galactinol)研究进展
        1.2.2 棉子糖合成酶(RS)与棉子糖(Raffinose)研究进展
    1.3 植物转录因子研究简介
        1.3.1 脱水响应元件结合蛋白2亚族(DREB2)研究进展
        1.3.2 热激转录因子(HSF)研究进展
    1.4 热激转录因子结合蛋白(HSBP)研究进展
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 玉米肌醇半乳糖苷合成酶的功能研究
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 植物材料
        2.2.2 菌种与载体
    2.3 实验方法
        2.3.1 载体构建
        2.3.2 玉米gols1纯合突变体鉴定与干旱胁迫
        2.3.3 序列比对
        2.3.4 玉米B73幼苗逆境胁迫处理
        2.3.5 玉米B73和拟南芥叶肉原生质体制备与转化
        2.3.6 拟南芥稳定转化
        2.3.7 MBP-ZmDREB2A蛋白诱导表达纯化与抗体制备
        2.3.8 亚细胞定位
        2.3.9 总RNA提取、RT-PCR和蛋白质印迹(westernblot)检测基因表达
        2.3.10 糖组分提取与含量测定
        2.3.11 转基因拟南芥的表型分析
        2.3.12 数据分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 ZmGOLS1和ZmGOLS2序列,逆境响应模式和亚细胞定位分析
        2.4.2 zmgols1突变体鉴定
        2.4.3 zmgols1突变体幼苗耐旱性鉴定
        2.4.4 zmgols1突变体成苗糖含量检测
        2.4.5 zmgols1突变体成熟种子糖含量检测
        2.4.6 超表达ZmGOLS2拟南芥株系糖含量检测
        2.4.7 超表达ZmGOLS2拟南芥株系优于超表达ZmDREB2A拟南芥植株
        2.4.8 超表达ZmGOLS2或ZmDREB2A拟南芥株系耐逆性显著提高
    2.5 讨论
第三章 超表达ZmGOLS2提高植物耐逆性的机制研究
    3.1 前言
    3.2 实验材料
        3.2.1 植物材料
    3.3 实验方法
        3.3.1 拟南芥植株表型分析
        3.3.2 气孔开度测定
        3.3.3 光系统II的稳定性测定
        3.3.4 实时定量RT-PCR检测
        3.3.5 数据分析
    3.4 结果与分析
        3.4.1 超表达ZmGOLS2拟南芥种子在萌发和子叶伸展阶段对外源ABA敏感
        3.4.2 超表达ZmGOLS2拟南芥在幼苗生长阶段对外源ABA敏感
        3.4.3 超表达ZmGOLS2拟南芥ABA合成通路相关基因上调表达
        3.4.4 ABA处理后超表达ZmGOLS2拟南芥叶片气孔开度降低
        3.4.5 ABA处理后拟南芥棉子糖缺失突变体(atrs5)叶片气孔开度降低
    3.5 讨论
第四章 玉米ZmGOLS2等位基因表达调控研究
    4.1 前言
    4.2 实验材料
        4.2.1 植物材料
    4.3 实验方法
        4.3.1 玉米自交系叶片基因组提取
        4.3.2 玉米自交系种胚总RNA提取与RT-PCR检测基因表达
        4.3.3 玉米自交系种胚总蛋白提取与westernblot分析
        4.3.4 ZmGOLS2蛋白原核诱导表达
        4.3.5 灰度分析
        4.3.6 全基因组关联(GWAS)分析
        4.3.7 ZmGOLS2抗体制备
    4.4 结果与分析
        4.4.1 不同玉米自交系种胚ZmGOLS2mRNA,蛋白和肌醇半乳糖苷含量检测
        4.4.2 不同玉米自交系种胚ZmGOLS2启动子区SNP研究
        4.4.3 不同玉米自交系种胚ZmGOLS2翻译调控研究
    4.5 讨论
第五章 ZmDREB2A调控ZmGOLS2表达的研究
    5.1 前言
    5.2 实验材料
        5.2.1 植物材料
        5.2.2 菌种与载体
    5.3 实验方法
        5.3.1 载体构建
        5.3.2 玉米叶肉原生质体制备和瞬时转化
        5.3.3 拟南芥稳定转化
        5.3.4 MBP-ZmDREB2A蛋白诱导表达纯化与抗体制备
        5.3.5 凝胶迁移实验(EMSA)
        5.3.6 实时定量RT-PCR和westernblot检测基因表达
        5.3.7 拟南芥干旱胁迫处理
        5.3.8 拟南芥叶片总糖提取与检测
        5.3.9 RNA提取与RNA-seq分析
        5.3.10 数据分析
    5.4 结果与分析
        5.4.1 ZmDREB2A正调控ZmGOLS2表达
        5.4.2 超表达ZmDREB2A拟南芥株系肌醇半乳糖苷和棉子糖含量分析
        5.4.3 超表达ZmDREB2A的玉米原生质体转录组分析
    5.5 讨论
第六章 ZmHSFA2和ZmHSBP2互作调控ZmGOLS2表达
    6.1 前言
    6.2 实验材料
        6.2.1 植物材料
        6.2.2 菌种与载体
    6.3 实验方法
        6.3.1 载体构建
        6.3.2 玉米B73幼苗逆境胁迫处理与成苗组织表达谱分析
        6.3.3 ZmHSFA2和ZmHSBP2序列比对
        6.3.4 玉米和拟南芥叶肉原生质体转化以及拟南芥稳定转化
        6.3.5 亚细胞定位,双分子荧光互补(BiFC)和酵母双杂交实验
        6.3.6 ZmHSFA2,ZmHSBP2或ZmGOLS2蛋白诱导表达纯化与抗体制备
        6.3.7 RT-PCR,实时定量RT-PCR和westernblot检测基因表达
        6.3.8 转基因拟南芥表型分析
        6.3.9 拟南芥叶片总糖提取与检测
        6.3.10 染色质免疫沉淀(ChIP)
        6.3.11 启动子顺式作用原件预测
        6.3.12 数据分析
    6.4 结果与分析
        6.4.1 ZmHSFA2和ZmHSBP2的序列,表达模式和亚细胞定位分析
        6.4.2 ZmHSFA2正调控ZmGOLS2的表达
        6.4.3 ZmHSFA2的转录活性受热激诱导的磷酸化调控
        6.4.4 超表达ZmHSFA2的拟南芥表型分析
        6.4.5 ZmHSFA2和ZmHSBP2互作分析
        6.4.6 超表达ZmHSBP2的拟南芥表型分析
        6.4.7 ZmHSBP2的表达受到ZmHSFA2及自身ZmHSBP2的调控
    6.5 讨论
        6.5.1 HSFA转录因子的结构和功能在植物界是保守的
        6.5.2 ZmHSFA2转录因子直接或间接调控ZmGOLS2表达
        6.5.3 ZmHSFA2的磷酸化以及存在形式
        6.5.4 HSFA2和HSBP2与植物的热激胁迫响应
        6.5.5 细胞如何响应热激胁迫？
    6.6 小结
第七章 全文总结
    7.1 全文主要结论
    7.2 本研究的创新点
    7.3 下步研究计划
参考文献
附录
缩略词
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]Identification and expression analysis of OsHsfs in rice[J]. Chuang WANG§, Qian ZHANG§, Hui-xia SHOU (State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, College of Life Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China).  Journal of Zhejiang University（Science B:An International Biomedicine ＆ Biotechnology Journal）. 2009(04)



本文编号：3659811