甘蓝型油菜BnGLIP1基因的克隆及其功能研究

发布时间：2022-07-19 17:17

　　甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是我国重要的油料作物,在长江中下游流域大量种植。不仅可用来生产食用油,而且其饼粕富含蛋白质,也可作为动物饲料。由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的菌核病是一种世界性重要病害,严重威胁着我国油菜的生产。生产上多采用化学法防治菌核病,但是存在着很多问题。近年来,植物GDSL脂肪酶家族基因功能的研究逐渐开展,但是关于甘蓝型油菜GDSL脂肪酶功能的研究较少,特别是抗菌核病领域。本研究中我们通过候选基因关联分析的方法,筛选到了一个与甘蓝型油菜菌核病抗性性状显著相关的基因,并围绕该基因进行了一系列研究工作。本研究的主要结果如下:我们克隆了这个与甘蓝型油菜菌核病抗性性状显著相关的基因,命名为BnGLIP1（B.napus GDSL LIPASE-LIKE 1）。首先通过生物信息学分析方法初步了解了BnGLIP1蛋白的性质,结果发现它属于植物SGNH脂肪酶家族,由360个氨基酸组成,含有20种氨基酸,分子质量约为39.5 KD,理论等电点为4.95。预测结果显示该蛋白磷酸化程度较高,此外它可能是一种亲水性蛋白。BnGLIP1... 

【文章页数】：91 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 油菜具有重要的农业生产地位
    1.2 植物抗病机制的研究进展
    1.3 核盘菌生物学特征及致病机理
        1.3.1 核盘菌生物学特征
        1.3.2 核盘菌的致病机理
    1.4 植物GDSL脂肪酶家族研究进展
        1.4.1 植物GDSL脂酶结构与种类
        1.4.2 植物GDSL脂酶的生物学功能
    1.5 油菜抗菌核病研究进展
    1.6 研究的目的和意义
    1.7 研究内容和技术路线
        1.7.1 主要研究内容
        1.7.2 技术路线
第二章 BnGLIP1基因的鉴定与克隆
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要试剂
    2.2 方法
        2.2.1 候选基因关联分析
        2.2.2 RNA的提取以及cDNA的合成
        2.2.3 BnGLIP1基因的克隆
        2.2.4 重组载体pMD18-T-BnGLIP1载体的构建
        2.2.5 抽提质粒送测序
    2.3 结果
        2.3.1 AtGDSL1同源基因的鉴定
        2.3.2 候选基因关联分析
        2.3.3 BnGLIP1基因的克隆
    2.4 讨论和小结
第三章 甘蓝型油菜BnGLIP1蛋白的生物信息学分析
    3.1 生物信息学分析方法
        3.1.1 蛋白保守结构域分析
        3.1.2 蛋白理化性质分析
        3.1.3 蛋白磷酸化位点和疏水性分析
        3.1.4 蛋白信号肽和亚细胞定位预测
    3.2 结果与分析
        3.2.1 BnGLIP1蛋白的保守结构域分析
        3.2.2 BnGLIP1的理化性质以及疏水性分析
        3.2.3 BnGLIP1的磷酸化位点预测
        3.2.4 BnGLIP1的信号肽以及亚细胞定位预测分析
    3.3 讨论与小结
第四章 BnGLIP1的表达模式分析以及胁迫响应
    4.1 材料和试剂
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要试剂配制
    4.2 方法
        4.2.1 植株生长条件
        4.2.2 组织表达模式分析
        4.2.3 生物激素的处理
        4.2.4 非生物胁迫处理
        4.2.5 生物胁迫处理
        4.2.6 RNA提取以及cDNA合成
        4.2.7 荧光定量PCR
    4.3 结果与分析
        4.3.1 BnGLIP1的组织表达模式分析
        4.3.2 BnGLIP1在不同激素处理下的响应分析
        4.3.3 BnGLIP1在不同环境胁迫下的响应分析
        4.3.4 BnGLIP1在核盘菌处理后的表达分析
    4.4 讨论与小结
第五章 BnGLIP1蛋白的亚细胞定位分析
    5.1 材料和试剂
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 菌种与载体
        5.1.3 主要试剂
        5.1.4 主要试剂配制方法
    5.2 实验方法
        5.2.1 亚细胞定位载体的构建
        5.2.2 农杆菌GV3101感受态细胞的重组载体转化
        5.2.3 BnGLIP1在烟草叶片中的瞬时转化
        5.2.4 亚细胞定位观察
    5.3 结果与分析
        5.3.1 亚细胞定位载体pK7FWG2.0-BnGLIP1的构建
        5.3.2 BnGLIP1蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位
    5.4 讨论与小结
第六章 过量表达BnGLIP1提高了植株对菌核病的抗性
    6.1 材料
        6.1.1 植物材料
        6.1.2 菌种与载体
        6.1.3 主要试剂
        6.1.4 主要试剂配制
    6.2 实验方法
        6.2.1 过表达载体的构建
        6.2.2 在烟草叶片中瞬时转化BnGLIP1
        6.2.3 核盘菌侵染瞬时表达BnGLIP1的烟草
        6.2.4 拟南芥的遗传转化
        6.2.5 拟南芥遗传转化株的筛选与鉴定
        6.2.6 核盘菌侵染拟南芥转化株
        6.2.7 台盼蓝染色
    6.3 结果与分析
        6.3.1 过表达载体pBI121-BnGLIP1的构建
        6.3.2 瞬时表达BnGLIP1增强烟草对核盘菌的抗性
        6.3.3 拟南芥遗传转化株的筛选与鉴定
        6.3.4 核盘菌侵染拟南芥
        6.3.5 台盼蓝染色检测细胞坏死
        6.3.6 核盘菌菌丝生长差异
    6.4 讨论与小结
第七章 BnGLIP1过量表达和抑制表达油菜株系的创建
    7.1 材料
        7.1.1 植物材料
        7.1.2 菌种与载体
        7.1.3 主要试剂
    7.2 实验方法
        7.1.1 BnGLIP1的抑制表达载体的构建
        7.1.2 油菜遗传转化培养基的配制
        7.1.3 甘蓝型油菜的遗传转化
        7.1.4 油菜阳性转化株的PCR鉴定
        7.1.5 油菜阳性转化株的qRT-PCR鉴定
    7.3 结果与分析
        7.3.1 BnGLIP1抑制表达载体的构建
        7.3.2 转化株的PCR鉴定
        7.3.3 qRT-PCR鉴定BnGLIP1过表达植株以及干扰植株
    7.4 讨论与小结
第八章 总结与展望
    8.1 工作总结
    8.2 工作展望
参考文献
致谢
在学期间发表的学术论文及其他科研成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]油菜产业发展现状及面临的机遇[J]. 谢慧,谭太龙,罗晴,杨柳,陈光辉.  作物研究. 2018(05)
[2]中国油菜生产技术供需的经济学分析[J]. 胡代玉,付茂宁.  农业与技术. 2018(12)
[3]2017年油料和食用植物油市场形势分析及2018年展望[J]. 张雯丽,许国栋.  农业展望. 2018(02)
[4]陆地棉GDSL脂肪酶增强拟南芥对黄萎病菌的抗性[J]. 袁哈利,郝晓云,郑学伟,李鸿彬.  石河子大学学报(自然科学版). 2015(05)
[5]植物天然免疫系统研究进展[J]. 陈英,谭碧玥,黄敏仁.  南京林业大学学报(自然科学版). 2012(01)
[6]用扫描仪及Image J软件精确测量叶片形态数量特征的方法[J]. 戴志聪,杜道林,司春灿,林英,郝建良,孙凤.  广西植物. 2009(03)
[7]荧光定量PCR数据处理方法的探讨[J]. 唐永凯,贾永义.  生物技术. 2008(03)
[8]茉莉酸类物质（JAs）的生理特性及其在逆境胁迫中的抗性作用[J]. 蔡昆争,董桃杏,徐涛.  生态环境. 2006(02)
[9]发展油菜生物柴油的潜力、问题与对策[J]. 王汉中.  中国油料作物学报. 2005(02)
[10]与植物超敏反应（HR）相关的细胞编程性死亡[J]. 夏启中,吴家和,张献龙.  华中农业大学学报. 2005(01)

硕士论文
[1]甘蓝型油菜BnMPK3抗菌核病功能研究[D]. 陈婷.江苏大学 2016
[2]通过调控GDSL转录水平提高甘蓝型油菜抗菌核病、种子萌发速度和含油量[D]. 郭小娟.江苏大学 2016



本文编号：3663822