甘蓝型油菜BnCLG1基因的克隆与功能鉴定

发布时间：2022-07-20 17:31

　　大多数陆生植物地上部分的体表都覆盖有一层天然的疏水屏障——角质层,是由表皮细胞合成并分泌的特殊的膜状结构,主要成分是角质和蜡质。它在植物抵御干旱、紫外线辐射、病原菌侵染等外界环境胁迫发挥着重要作用。前人已对拟南芥的角质蜡质合成途径以及相关基因开展了许多研究,但有关甘蓝型油菜蜡质合成及其分子调控的相关研究迄今报道较少。在本研究中,我们首先对甘蓝型油菜"中双11号"中与拟南芥CER9基因同源的BnCLG1基因及其启动子进行了克隆,并利用GUS染色、半定量PCR、荧光定量PCR及遗传转化等技术初步研究了它们在角质蜡质合成中的功能,旨在探讨甘蓝型油菜角质蜡质合成的基本分子机制。取得的主要结果总结如下:1、生物信息学分析结果表明:甘蓝型油菜BnCLG1基因与拟南芥CER9基因同源,且在油菜基因组上有2个拷贝,分别命名为BnCLGLA和BnCLG1C。它们的基因结构中都包含9个外显子,8个内含子。BnCLG1A编码1110个氨基酸,BnCLG1C编码1108个氨基酸,都是具有14个跨膜域的疏水性质膜蛋白。它们翻译的蛋白都含有RING finger结构域,都属于E3泛素蛋白连接酶家族。BnCLG1基... 

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词名词表
1 文献综述
    1.1 植物角质层相关研究进展
        1.1.1 角质层的化学组成和结构
        1.1.2 角质层角质的合成与运输
    1.2 植物蜡质的相关进展
        1.2.1 外层蜡质的合成过程
        1.2.2 内层蜡质的合成
        1.2.3 蜡质的分泌途径
        1.2.4 蜡质合成与调控相关基因
    1.3 环境对角质层蜡质的影响
    1.4 泛素化途径
        1.4.1 泛素及泛素化过程
        1.4.2 泛素化酶
    1.5 本研究的目的及意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和质粒
        2.1.3 实验所用引物
        2.1.4 主要试剂盒与生化试剂
    2.2 甘蓝型油菜BnCLG1基因启动子的克隆
        2.2.1 基因组DNA的提取
        2.2.2 BnCLG1启动子的扩增与回收
        2.2.3 BnCLG1基因启动子的表达载体构建
        2.2.4 BnCLG1基因启动子元件分析
    2.3 甘蓝型油菜BnCLG1的克隆与序列分析
        2.3.1 总RNA的提取
        2.3.2 单链cDNA的合成
        2.3.3 BnCLG1全长CDS序列的扩增与回收
        2.3.4 BnCLG1超表达载体的构建
        2.3.5 BnCLG1基因的生物信息学分析
    2.4 农杆菌介导的拟南芥遗传转化与阳性检测
        2.4.1 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备
        2.4.2 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的转化
        2.4.3 拟南芥植株的种植
        2.4.4 农杆菌侵染液的制备与转化
        2.4.5 转基因幼苗的PCR阳性鉴定
    2.5 BnCLG1启动子在拟南芥中的GUS组织化学定位
    2.6 BnCLG1的表达分析
        2.6.1 BnCLG1A和BnCLG1C基因的RT-PCR
        2.6.2 BnCLG1A和BnCLG1C基因在干旱、盐逆境胁迫下和不同激素(GA3、ABA、SA)处理的Real-time PCR
    2.7 BnCLG1超表达拟南芥的表型观察与抗旱性分析
        2.7.1 表型观察
3 结果与分析
    3.1 甘蓝型油菜BnCLG1基因启动子的克隆与表达载体构建
    3.2 甘蓝型油菜BnCLG1启动子元件分析
    3.3 甘蓝型油菜BnCLG1启动子的GUS组织化学定位
    3.4 甘蓝型油菜BnCLG1基因的克隆和序列分析
        3.4.1 BnCLG1A、BnCLG1C蛋白的理化性质分析
        3.4.2 BnCLG1A、BnCLG1C结构域和二、三级结构的预测
        3.4.3 BnCLG1A、BnCLG1C信号肽及亚细胞定位的预测
        3.4.4 BnCLG1A、BnCLG1C多序列比对和进化分析
        3.4.5 BnCLG1A、BnCLG1C的功能预测
    3.5 甘蓝型油菜BnCLG1基因的超表达载体构建和遗传转化
        3.5.1 BnCLG1表达载体的构建
        3.5.2 BnCLG1基因超表达载体的遗传转化和转基因阳性检测
    3.6 BnCLG1基因的表达分析
        3.6.1 BnCLG1基因在不同组织的时空表达
        3.6.2 BnCLG1基因在非生物胁迫与激素处理下的表达
    3.7 BnCLG1基因超表达表型观察
4 讨论与结论
    4.1 BnCLG1基因启动子的分析
    4.2 BnCLG1基因的分析
        4.2.1 BnCLG1基因序列及氨基酸序列分析
        4.2.2 BnCLG1基因的表达分析
    4.3 BnCLG1超表达植株的表型变化
    4.4 结论
参考文献
附录一
附录二
附录三
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]SA、MeJA和ACC处理对甘蓝型油菜叶角质层蜡质组分、结构及渗透性的影响[J]. 李帅,赵秋棱,彭阳,徐熠,李加纳,倪郁.  作物学报. 2016(12)
[2]外源SA影响油菜叶表皮蜡质及菌核病抗性的机制[J]. 倪郁,王婧,宋超,夏瑞娥,孙正圆,郭彦军,李加纳.  作物学报. 2013(01)
[3]油菜一个WRKY基因对盐胁迫和干旱胁迫的表达响应[J]. 王景娜,高勇,安金玲,王志君,王茂林.  四川大学学报(自然科学版). 2010(01)
[4]ABA与植物的耐盐性[J]. 刘琳,曾幼玲,张富春.  植物生理学通讯. 2009(02)
[5]植物表皮蜡质的研究进展及WIN1对植物表皮蜡质的影响[J]. 李法莲,张淼,朱彩霞,邵群.  现代农业科技. 2008(11)
[6]植物角质层蜡质合成与调控的分子生物学研究进展[J]. 胡晓敏,张志飞,饶力群,黄卫.  武汉植物学研究. 2007(04)
[7]一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法[J]. 杨双,阮燕晔,樊金娟,张立军.  沈阳农业大学学报. 2005(01)
[8]干旱胁迫与ABA的信号转导[J]. 刘子会,郭秀林,王刚,李广敏.  植物学通报. 2004(02)
[9]盐生和中生环境中宁枸杞叶显微和超微结构的研究[J]. 郑文菊,张承烈.  草业学报. 1998(03)
[10]赤霉素对稻秆抗瘟性影响的分析[J]. 黎起秦,陈育新,韦绍兴.  广西农学院学报. 1990(01)



本文编号：3664433