地衣芽孢杆菌T-1群体感应淬灭基因ytnP的克隆表达及其功能研究

发布时间：2022-10-20 18:42

　　革兰氏阴性菌在水产动物病原菌中种类最多,是水产动物主要致病性病原菌。N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）,是革兰氏阴性菌致病性应答系统中的关键信号分子。当菌群中AHLs累计到一定浓度后,能激活病原菌致病基因的表达,导致病害的发生。N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解AHLs的金属蛋白水解酶,存在广泛,在多种微生物中均有发现。近年来,N-酰基高丝氨酸内酯酶作为群体感应淬灭策略的工具酶成为研究的热点。本研究的目的是通过对地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis T-1）中的N-酰胺内酯酶基因ytn P进行克隆表达,研究其作用与功能,从群体感应抑制角度,探索水产细菌性病害的新的路径,为水产业的健康可持续发展提供技术保障。1.ytn P基因的全长克隆及生物学分析本研究自地衣芽孢杆菌T-1全基因组测序得到ytn P基因的全长序列,通过PCR扩增目的基因ytn P,连接克隆载体pGEM-T Easy Vector,筛选阳性克隆并进一步测序鉴定,得到ytnP的全长900 bp序列;通过对ytn P的生物信息学分析发现,ytn P编... 

【文章页数】：91 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 细菌的群体感应系统
        1.1.1 革兰氏阴性菌的LuxI/LuxR系统
        1.1.2 革兰氏阳性菌的双组分群体感应系统
        1.1.3 LuxS/AI-2依赖的群体感应系统
        1.1.4 其他的QS系统
        1.1.5 群体感应与病原菌致病性
    1.2 嗜水气单胞菌的群体感应系统
        1.2.1 嗜水气单胞菌简介
        1.2.2 嗜水气单胞菌的群体感应系统
        1.2.3 嗜水气单胞菌的毒力因子
        1.2.4 嗜水气单胞菌的生物被膜
    1.3 群体感应淬灭酶
        1.3.1 群体感应淬灭
        1.3.2 AHL内酯酶
        1.3.3 AHLs酰化酶
        1.3.4 AHLs氧化还原酶
    1.4 本研究的目的和意义
第二章 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)T-1的ytnP基因全长的克隆及分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 试剂与工具酶
        2.1.3 缓冲液和培养基
        2.1.4 引物合成
        2.1.5 主要实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 地衣芽孢杆菌T-1基因组的提取
        2.2.2 ytnP扩增引物的设计
        2.2.3 ytnP的全长克隆
        2.2.4 ytnP序列的生物信息学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 地衣芽孢杆菌T-1基因组提取
        2.3.2 地衣芽孢杆菌T-1ytnP基因的全长克隆
        2.3.3 ytnP序列的生物信息学分析
    2.4 讨论
第三章 ytnP的原核表达,纯化与酶活测定
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株与质粒
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 溶液配置
        3.1.4 引物合成
        3.1.5 主要实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 大肠杆菌表达载体pEASY-BluntE1-ytnP的构建
        3.2.2 ytnP在大肠杆菌中的表达与检测
        3.2.3 重组酶YtnP的纯化
        3.2.4 重组酶YtnP的透析复性
        3.2.5 BCA蛋白定量测定蛋白浓度
        3.2.6 YtnP活性测定
        3.2.7 Ytnp的酶活测定
    3.3 结果与分析
        3.3.1 高保真酶克隆ytnP
        3.3.2 重组酶YtnP在大肠杆菌中的表达鉴定
        3.3.3 YtnP的纯化
        3.3.4 YtnP的透析复性
        3.3.5 BCA测定蛋白浓度
        3.3.6 YtnP酶活测定
    3.4 讨论
第四章 YtnP对嗜水气单胞菌生物膜的影响
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 培养基
        4.1.4 仪器设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 YtnP的制备
        4.2.2 嗜水气单胞菌初始浓度对生物膜形成的影响
        4.2.3 YtnP对嗜水气单胞菌生物膜的抑制作用
        4.2.4 4种抗生素对嗜水气单胞菌最小抑菌浓度(Minimal Inhibit Concentration,MIC)的测定
        4.2.5 YtnP和抗生素协同作用对嗜水气单胞菌MIC的影响
        4.2.6 数据处理
    4.3 结果与分析
        4.3.1 不同浓度的嗜水气单胞菌对其生物膜形成的影响
        4.3.2 YtnP对嗜水气单胞菌生物膜的抑制作用
        4.3.3 4种抗生素对嗜水气单胞菌的MIC测定结果
        4.3.4 YtnP与抗生素的协同作用对嗜水气单胞菌MIC的影响
    4.4 讨论
第五章 YtnP对嗜水气单胞菌毒力因子表达调控研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验菌株和实验用鱼
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 溶液
        5.1.4 主要仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 细菌生长曲线绘制
        5.2.2 细菌RNA的提取
        5.2.3 细菌RNA质量的检测
        5.2.4 细菌RNA的反转录
        5.2.5 荧光定量PCR检测毒力基因表达
        5.2.6 溶血活性测定
        5.2.7 YtnP对异育银鲫(C.auratusgibelio)的保护实验
        5.2.8 数据分析
    5.3 结果与分析
        5.3.1 嗜水气单胞菌生长曲线
        5.3.2 荧光定量引物验证
        5.3.3 添加YtnP对嗜水气单胞菌毒力基因表达量的影响
        5.3.4 溶血活性测定
        5.3.5 重组酶YtnP对异育银鲫的保护实验
    5.4 讨论
全文总结
展望
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3695100