卵形鲳鲹两种抗菌肽基因功能及转录调控研究

发布时间：2022-11-05 15:16

　　卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）是中国和亚太地区重要的海水养殖物种之一,具有生长速度快,经济价值高,适合网箱养殖等优点。随着养殖业的发展,抗生素的用量也逐渐增大,不仅污染环境,还会导致病原体产生抗药性。抗菌肽抑菌机理与抗生素不同,不易产生抗药性,是抗生素的潜在替代物,筛选相关的抗菌肽基因可以用于培育优良品种。为了研究卵形鲳鲹抗菌肽基因功能及调控机制,本研究扩增了LEAP-2和NK-lysin基因cDNA全长序列,通过生物信息学分析了基因的结构特征,用其编码的氨基酸序列与其他物种进行多重比对,构建进化树。经美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae）刺激卵形鲳鲹后,利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）分析LEAP-2和NK-lysin基因的组织差异表达及组织分布。克隆了基因的成熟肽片段,构建原核表达载体,并成功在体外表达。扩增了LEAP-2和NK-lysin基因启动子序列,通过构建荧光素酶报告基因重组质粒检测活性,筛选核心启动子。利用PCR介导的定点突变技术,构建转录因子结合位点突变体,通过构建荧光素酶报告基因重组质粒检测活性,筛选出主要转录因... 

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
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第一章 引言
    1.1 卵形鲳鲹简介
    1.2 鱼类免疫系统
    1.3 抗菌肽的研究进展
        1.3.1 鱼类LEAP-2 研究进展
        1.3.2 鱼类NK-lysin研究进展
    1.4 抗菌肽表达调控机制
    1.5 研究目的及意义
第二章 卵形鲳鲹LEAP-2 和NK-lysin基因的表达差异分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验用鱼及菌种
        2.1.2 主要仪器及试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 组织样品采集
        2.2.2 总RNA提取
        2.2.3 cDNA模板合成
        2.2.4 基因序列生物信息学分析
        2.2.5 实时荧光定量PCR
    2.3 实验结果
        2.3.1 LEAP-2 基因生物信息学分析
        2.3.2 NK-lysin基因生物信息学分析
        2.3.3 LEAP-2和NK-lysin组织差异表达
        2.3.4 美人鱼发光杆菌刺激表达分析
    2.4 讨论
第三章 卵形鲳鲹LEAP-2和NK-lysin原核表达
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验用鱼
        3.1.2 主要试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 样品采集
        3.2.2 RNA提取
        3.2.3 cDNA第一条链的合成
        3.2.4 重组质粒的构建
        3.2.5 pET32a/mLEAP-2 蛋白表达和纯化
        3.2.6 pET32a/mLEAP-2 蛋白Western blot检测
        3.2.7 pET32a/mLEAP-2 蛋白抑菌活性检测
        3.2.8 PGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白表达和纯化
        3.2.9 PGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白Western blot检测
        3.2.10 PGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白抑菌活性检测
    3.3 结果
        3.3.1 pET32a/mLEAP-2 重组质粒的构建
        3.3.2 pET32a/mLEAP-2 蛋白诱导表达
        3.3.3 pET32a/mLEAP-2 蛋白的纯化
        3.3.4 pET32a/mLEAP-2 蛋白Western blot检测
        3.3.5 pET32a/mLEAP-2 蛋白抑菌活性检测
        3.3.6 pGEX-6P-1/NK-lysin重组质粒构建
        3.3.7 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白诱导表达
        3.3.8 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白的纯化及复性
        3.3.9 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白Western blot
        3.3.10 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白抑菌圈检测
        3.3.11 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白最小抑菌活性检测
    3.4 讨论
第四章 卵形鲳鲹LEAP-2 和NK-lysin基因启动子分析
    4.1 实验材料
        4.1.1.实验用细胞系
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 DNA的提取
        4.2.2 启动子生物信息学分析
        4.2.3 启动子序列扩增
        4.2.4 启动子缺失片段重组质粒的构建
        4.2.5 细胞转染
        4.2.6 双荧光素酶检测
        4.2.7 转录因子点突变质粒的构建
        4.2.8 细胞转染
        4.2.9 双荧光素酶检测
    4.3 实验结果
        4.3.1 LEAP-2 启动子序列分析
        4.3.2 LEAP-2 启动子缺失片段重组质粒的构建
        4.3.3 LEAP-2 启动子缺失片段重组质粒的活性测定
        4.3.4 LEAP-2 启动子转录因子突变质粒的构建
        4.3.5 LEAP-2 启动子突变转录因子活性检测
        4.3.6 NK-lysin启动子序列分析
        4.3.7 NK-lysin启动子缺失片段重组质粒的构建
        4.3.8 NK-lysin启动子缺失片段重组质粒的活性检测
        4.3.9 NK-lysin启动子转录因子突变质粒的构建
        4.3.10 NK-lysin启动子转录因子突变质粒的活性检测
    4.4 讨论
结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]虹鳟免疫诱导型基因Cathelicidin2启动子功能分析[J]. 赵紫霞,许建,江炎亮,白庆利,蒋立坤,陈葆华,徐鹏.  渔业科学进展. 2018(04)
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[3]草鱼NK-lysin基因的克隆、原核表达与活性分析[J]. 王改玲,王明成,李传凤,潘磊,刘盼婷.  水产学报. 2017(10)
[4]斑点叉尾LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性[J]. 孙立人,陶妍,高北.  上海海洋大学学报. 2017(01)
[5]团头鲂白细胞介素6基因启动子报告载体的构建及活性分析[J]. 扶晓琴,丁祝进,饶友亮,王卫民,刘红.  华中农业大学学报. 2016(01)
[6]大黄鱼肝表达抗菌肽2基因的克隆和原核表达[J]. 蔡灿,薛良义,孙爱飞.  生物学杂志. 2012(04)
[7]斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肝脏表达的抗菌肽-2（LEAP-2）在E.coli中的融合表达[J]. 张虹,陶妍.  上海交通大学学报(农业科学版). 2010(01)

硕士论文
[1]大弹涂鱼抗菌肽hepcidin基因的分子克隆与表达研究[D]. 潘燕秋.深圳大学 2016
[2]半滑舌鳎三个免疫相关基因克隆、表达及CD40启动子甲基化初步分析[D]. 位战飞.上海海洋大学 2016



本文编号：3702842