高地芽孢杆菌W3碱性蛋白酶的基因克

发布时间：2022-12-03 23:23

　　碱性蛋白酶（alkaline proteases,AprEs）可以水解肽键,生成氨基酸或肽类物质,具有良好的耐热、耐碱能力,因而广泛地应用于洗涤、制革、纺织、医药、食品等领域。AprEs应用前景广阔,然而目前对AprEs的研究仍然集中在洗涤剂添加剂方面。因此,挖掘新型AprEs并进一步拓宽其应用范围具有重要的意义。论文从筛选高活性的AprE生产菌株出发,通过分析其基因组,从中挖掘新型的AprE基因对其进行克隆表达,并研究重组酶的酶学性质及其在手性药物拆分和牛奶蛋白质脱敏中的应用,具有一定的意义和价值。论文的主要研究成果如下:（1）对实验室保藏的芽孢杆菌进行平板初筛,得到4株具有明显AprE生产能力的菌株;经过发酵培养和酶活测定,得到一株高活性AprE生产菌株W3,酶活高达69.88U·mL^-1,先前已被鉴定和命名为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis W3）。（2）利用B.altitudinis W3全基因组信息,筛选得到51条蛋白酶基因,其中有9条被初步确定为AprE基因,分别命名为baapr1-9。对这9条AprE基因进行生物信息学分析与克隆... 

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 碱性蛋白酶的概述
        1.1.1 蛋白酶的分类
        1.1.2 碱性蛋白酶的性质及分类
        1.1.3 碱性蛋白酶作用机制
        1.1.4 碱性蛋白酶的来源
    1.2 碱性蛋白酶的研究进展
        1.2.1 传统菌种选育与菌种改良
        1.2.2 异源表达
        1.2.3 基因挖掘
        1.2.4 基因编辑
        1.2.5 蛋白质工程
    1.3 碱性蛋白酶的应用
        1.3.1 碱性蛋白酶在洗涤行业中的应用
        1.3.2 碱性蛋白酶在制革行业中的应用
        1.3.3 碱性蛋白酶在纺织行业中的应用
        1.3.4 碱性蛋白酶在医药行业中的应用
        1.3.5 碱性蛋白酶在食品行业中的应用
    1.4 论文立题依据和主要研究内容
        1.4.1 论文的立题依据
        1.4.2 论文的研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 仪器与设备
        2.1.3 试剂与材料
        2.1.4 培养基
        2.1.5 溶液和缓冲液
    2.2 实验方法
        2.2.1 基本检测方法
        2.2.2 产酶菌株的筛选
        2.2.3 生物信息学分析
        2.2.4 基因组的提取
        2.2.5 基因的克隆及重组载体的构建
        2.2.6 感受态细胞的制备及重组载体的转化
        2.2.7 重组蛋白的表达及验证
        2.2.8 生长曲线和酶活曲线的测定
        2.2.9 重组蛋白的分离纯化
        2.2.10 酶学性质研究
        2.2.11 手性药物的拆分与检测
        2.2.12 牛奶蛋白质的水解与检测
        2.2.13 数据分析及绘图
第三章 结果与讨论
    3.1 菌株的筛选
        3.1.1 初筛
        3.1.2 复筛
    3.2 生物信息学分析
        3.2.1 蛋白酶基因的统计与分类
        3.2.2 碱性蛋白酶的初步确定
        3.2.3 碱性蛋白酶的信号肽预测与分析
        3.2.4 保守结构域分析
    3.3 基因克隆与表达
        3.3.1 碱性蛋白酶在大肠杆菌中的克隆表达
        3.3.2 碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的克隆表达
        3.3.3 碱性蛋白酶的异源活性表达
        3.3.4 生长曲线与酶活曲线的测定
        3.3.5 分离纯化
        3.3.6 序列比对
    3.4 酶学性质
        3.4.1 最适pH和pH稳定性
        3.4.2 最适温度和温度稳定性
        3.4.3 金属离子和添加剂
        3.4.4 底物特异性
        3.4.5 动力学参数
    3.5 碱性蛋白酶的应用
        3.5.1 碱性蛋白酶在手性药物拆分中的应用
        3.5.2 碱性蛋白酶在牛奶蛋白质脱敏中的应用
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录1 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文
附录2 :基因序列


【参考文献】：
期刊论文
[1]微生物碱性蛋白酶的研究与开发[J]. 刘逸寒,王洪彬,刘夫锋,张会图,秦慧民,路福平.  天津科技大学学报. 2017(02)
[2]产低温蛋白酶海洋菌筛选、鉴定及性质的初步研究[J]. 权淑静,马焕,刘德海,解复红.  河南科学. 2017(01)
[3]介导纳豆激酶分泌表达的信号肽比较[J]. 何孝天,刘中美,崔文璟,周哲敏.  现代食品科技. 2014(05)
[4]Enteric bacterial proteases in inflammatory bowel diseasepathophysiology and clinical implications[J]. Ian M Carroll,Nitsan Maharshak.  World Journal of Gastroenterology. 2013(43)
[5]高水解度大豆寡肽专用复合酶的配方优化[J]. 梁秋丽,方佳茂,罗石柱,殷军帅,孙中涛.  食品科学. 2012(23)
[6]微生物碱性蛋白酶研究进展[J]. 邓菊云.  现代食品科技. 2008(03)
[7]提高C1213菌碱性蛋白酶活力的研究[J]. 郑铁曾,涂提坤,黄登禹,暴学玉.  食品与发酵工业. 1993(01)

博士论文
[1]三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究[D]. 孙倩.中国农业大学 2016
[2]脱毛蛋白酶产生菌的选育及其碱性蛋白酶基因的克隆与表达[D]. 王海燕.四川大学 2006

硕士论文
[1]CotA漆酶突变体在毕赤酵母中分泌表达及对伊文斯蓝降解机制研究[D]. 夏静.江南大学 2019
[2]自裂解型人工适体核酶的设计及其在枯草芽胞杆菌基因表达中的应用[D]. 缪胜男.江南大学 2019
[3]解淀粉芽孢杆菌YP6磷酸酯酶的基因克隆、表达、酶学性质及应用[D]. 江威.江南大学 2018
[4]皮革加工工艺污染物排放特征研究[D]. 赵浩然.黑龙江大学 2018
[5]碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究[D]. 杨丽媛.东北师范大学 2015
[6]高产碱性蛋白酶重组菌及其发酵性能[D]. 黄文晶.江南大学 2012
[7]硫（硒）代枯草杆菌蛋白酶水解活力的研究[D]. 李楠.吉林大学 2010



本文编号：3707179