黑曲霉β-甘露聚糖酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达

发布时间：2022-12-18 07:18

　　采用RT-PCR方法从黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因（manA）cDNA,按照毕赤酵母密码子优化序列后,构建至毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoR I和Not I酶切位点之间,并与醇氧化酶强启动子序列和α因子分泌肽信号序列融合。构建好的载体进行大肠杆菌转化,提取大量质粒并用Sac I线性化后进行毕赤酵母转化,筛选鉴定获得酵母转化子。重组菌接种到YPD培养基中摇瓶培养24 h后,经甲醇诱导,取发酵上清液经SDS-PAGE检测到预期分子量大小的目标蛋白带,β-甘露聚糖酶最高酶活为125.78 IU/mL,酶的比活力为188.86 IU/mg。结果表明β-甘露聚糖酶基因已在毕赤酵母中成功表达并能有效分泌到细胞外。 

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 质粒、菌株、培养基、酶和主要试剂
    1.2 试验方法
        1.2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶克隆
        1.2.2 重组表达载体的构建
        1.2.3 重组表达载体LiAc法转入毕赤酵母
        1.2.4 毕赤酵母转化子的PCR鉴定与活性筛选
        1.2.5 重组毕赤酵母的诱导表达、分离纯化与SDS-PAGE电泳
            1) 诱导表达:
            2) 分离纯化与SDS-PAGE电泳:
        1.2.6 重组β-甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌酶活检测
2 结果与分析
    2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的克隆及检测
    2.2 酵母重组表达载体pPIC9K/α-manA的构建与鉴定
    2.3 阳性克隆PCR与筛选结果
    2.4 β-甘露聚糖酶基因的在工程菌中的表达
        2.4.1 重组酶蛋白的SDS-PAGE检测
        2.4.2 重组表达菌株酶活检测
    2.5 讨 论
3 结 论


【参考文献】：
期刊论文
[1]耐酸性β-甘露聚糖酶产生菌的筛选鉴定及培养基优化[J]. 张自平,李市场,龚明贵,刘永康,冯腾柱,赵晓丹.  中国食品添加剂. 2019(12)
[2]碱性β-甘露聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化[J]. 汤文晶,李松,马忠宝,杨倩,汤斌.  食品与发酵工业. 2019(23)
[3]酶法制备几种功能性低聚糖的研究进展[J]. 杨绍青,刘学强,刘瑜,李延啸,江正强.  生物产业技术. 2019(04)
[4]微生物β-甘露聚糖酶的研究进展[J]. 张建新,宋宜乐,冯军厂,常绪路.  中国酿造. 2019(04)
[5]木聚糖酶和甘露聚糖酶在毕赤酵母中的共表达及产酶分析[J]. 姚银,闵琪,熊海容,张莉.  中国生物工程杂志. 2019(03)
[6]β-甘露聚糖酶分子生物学研究进展[J]. 张蕊,朱虹,周峻沛,黄遵锡.  中国农业科技导报. 2018(05)
[7]酵母生产类胡萝卜素的研究进展[J]. 钮亭亭,孙茜萍,吴涛.  发酵科技通讯. 2017(01)
[8]β-甘露聚糖酶生产菌株的筛选鉴定及发酵条件的研究[J]. 李晓艳,张庆芳,于爽,迟乃玉.  大连大学学报. 2016(03)
[9]甘露聚糖酶对动物生产性能的影响[J]. 张金伟.  饲料工业. 2016(12)
[10]β-甘露聚糖酶基因的克隆及原核表达载体的构建[J]. 张云晖,关珍贞,王霞.  吉林农业. 2016(11)

博士论文
[1]细菌来源新型低温耐盐甘露聚糖酶的研究[D]. 张蕊.云南师范大学 2018
[2]一种耐高温β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中高效表达及其耐高温机理分析[D]. 罗长财.江南大学 2018

硕士论文
[1]嗜热菌来源新型β-甘露聚糖酶基因异源表达及饲用价值初探[D]. 严琳.西南民族大学 2019
[2]黑曲霉固态发酵制备β-甘露聚糖酶及其分离纯化[D]. 张晓燕.南京林业大学 2014
[3]黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶基因克隆与表达的研究[D]. 赵顺阁.江南大学 2012



本文编号：3721615