迟缓爱德华氏菌EvpC基因的原核表达及其免疫荧光定位研究

发布时间：2022-12-18 21:01

　　本研究从发病黄颡鱼体内分离出一株病原菌,命名为GD1609211。通过生理生化特征、染色镜检以及16S rRNA基因序列分析等方法,确定GD1609211为迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda E.tarda）。通过构建E.tarda-EvpC原核表达质粒并诱导表达,并制备该蛋白的多克隆抗体,从而对表达蛋白抗体介导的免疫荧光检测人工感染E.tarda后EvpC基因在黄颡鱼体内的表达时相与蛋白定位分析,以探讨EvpC基因功能,为深入了解T6SS致病机理提供重要理论依据。主要结果如下:1.采集患病黄颡鱼病料,其主要症状为下颌出血,肛门红肿,头部皮肤破溃以及肝脏出血肿胀。从发病黄颡鱼的肝脏以及肾脏内分离纯化得到一株病原菌,命名为G D1609211。表型、生理生化以及16S rRNA引物测序等方法鉴定,结果显示:GD1609211镜检为革兰氏阴性短杆状菌,在营养琼脂上形成灰白色圆形凸起、表面光滑的菌落。16S rRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性为99%,构建系统发育分析显示与迟缓爱德华氏菌聚为一支,该病原菌具有产酸产气、产吲哚、产硫化氢,能够在半固体琼脂生长等迟缓爱德华... 

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 迟缓爱德华氏菌分类地位及生物学特性
    1.2 迟缓爱德华氏菌的生物学危害
    1.3 迟缓爱德华氏菌的致病机制和主要毒力因子
    1.4 迟缓爱德华氏菌检测技术的研究进展
    1.5 免疫荧光技术在病原分布与定位研究中的应用
    1.6 本文研究的目的与意义
第二章 迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及药敏分析
    2.1 材料
        2.1.1 病料来源
        2.1.2 主要试剂和培养基配制
        2.1.3 主要仪器
    2.2 方法
        2.2.1 细菌分离纯化及抹片镜检
        2.2.2 细菌的生理、生化鉴定
        2.2.3 半数致死量的测定
        2.2.4 菌株16S rRNA基因序列的测定及系统发育树的构建
        2.2.5 毒力基因的测定
        2.2.6 药敏试验
    2.3 结果与分析
        2.3.1 分离菌的形态特征
        2.3.2 病原菌的生理、生化鉴定
        2.3.3 16S rRNA基因序列的鉴定及发育树的构建
        2.3.4 毒力基因的测定
        2.3.5 半数致死量的测定
        2.3.6 药敏试验
    2.4 结论与讨论
第三章 迟缓爱德华氏菌EvpC基因的克隆与序列分析
    3.1 材料
        3.1.1 菌种、质粒、宿主菌
        3.1.2 工具酶及试剂
    3.2 方法
        3.2.1 引物设计与合成
        3.2.2 EvpC基因的PCR扩增
        3.2.3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
        3.2.4 PCR产物的回收纯化
        3.2.5 感受态细胞的制备
        3.2.6 线性化表达载体pET-28b空质粒
    3.3 结果与分析
        3.3.1 EvpC的 PCR扩增结果
        3.3.2 重组质粒pET-28b-EvpC的双酶切鉴定及PCR鉴定结果
        3.3.3 EvpC基因的测序及序列分析
    3.4 结论与讨论
第四章 迟缓爱德华氏菌EvpC蛋白的诱导表达、抗体制备及应用
    4.1 材料
        4.1.1 载体、菌株
        4.1.2 实验动物
        4.1.3 仪器
        4.1.4 主要试剂及其配制
    4.2 方法
        4.2.1 EvpC基因原核表达蛋白的诱导表达及纯化
        4.2.2 兔抗E.tarda-EvpC重组蛋白抗体的制备及纯化
        4.2.3 基于兔抗EvpC重组蛋白IgG介导的免疫荧光法检测E.tarda感染黄颡鱼组织的应用
    4.3 结果与分析
        4.3.1 重组质粒的表达纯化
        4.3.2 EvpC蛋白多克隆抗体的制备
        4.3.3 免疫荧光检测人工感染迟缓爱德华氏菌黄颡鱼组织EvpC基因编码蛋白方法的建立与优化
    4.4 结论与讨论
        4.4.1 迟缓爱德华氏菌EvpC基因的表达纯化
        4.4.2 兔抗重组蛋白pET-28b-EvpC抗体IgG的制备与纯化
        4.4.3 人工感染E.tarda后 EvpC基因在黄颡鱼组织蛋白表达时相、侵染过程与定位分布
全文总结
参考文献
攻读学位期间发表和录用的论文
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]罗氏沼虾致病性溶藻弧菌的鉴定及药敏分析[J]. 苗鹏飞,杨映,谭淑雯,陈言峰,彭钟琴,吴勇亮,于辉.  水产科学. 2018(03)
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[5]免疫荧光技术及其在水产动物疾病检测中的应用[J]. 王金雨,刘志超,赵晓东.  江西水产科技. 2017(02)
[6]鲮鱼致病性迟钝爱德华氏菌的鉴定及药敏分析[J]. 陈言峰,卓孝磊,王超,郑宗正,付强.  水产科学. 2017(01)
[7]鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法[J]. 周勇,范玉顶,徐进,马杰,江南,刘文枝,曾令兵.  淡水渔业. 2017(01)
[8]宁波-舟山港口航道水域致病性细菌的毒力基因型鉴定[J]. 管峰,陈吉刚,毛芝娟,杨季芳.  应用海洋学学报. 2016(02)
[9]乌鳢溃烂病病原分析[J]. 陈言峰,周爱国,邹记兴,陈建酬,张继平,张辉华.  水产科技情报. 2015(04)
[10]嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究[J]. 郑宗林,郑曙明,Delbert M.Gatlin Ⅲ,汪开毓.  淡水渔业. 2015(05)

博士论文
[1]迟缓爱德华氏菌高效疫苗的设计、构建以及免疫机制研究[D]. 孙云.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2013
[2]养殖鱼类病原菌检测芯片技术的建立[D]. 李永芹.中国海洋大学 2010
[3]鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性和UL24基因的发现、原核表达及应用研究[D]. 贾仁勇.四川农业大学 2008

硕士论文
[1]黄鳝源迟缓爱德华氏菌的鉴定、分型及全基因组测序[D]. 邵建春.华中农业大学 2016
[2]鸡XOD亚基的原核表达、定位及其在NIBV感染后的蛋白表达量分析[D]. 林华源.江西农业大学 2016
[3]迟缓爱德华氏菌和鳗弧菌灭活疫苗的免疫佐剂筛选[D]. 张华.华东理工大学 2016
[4]迟缓爱德华氏菌效应物的鉴定及初步功能评价[D]. 黄亚珺.华东理工大学 2015
[5]大菱鲆迟缓爱德华氏菌抗体检测试纸条的研制及应用[D]. 甘玲玲.中国海洋大学 2013
[6]大菱鲆（Scophthalmus maximus）迟缓爱德华氏菌病免疫防控研究[D]. 王冲.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2013
[7]迟缓爱德华氏菌唾液酸酶的克隆表达与功能研究[D]. 靳仁娉.中国海洋大学 2012
[8]迟缓爱德华氏菌糖基转移酶MltA的功能研究[D]. 刘文正.中国海洋大学 2012
[9]哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的原核和真核表达[D]. 何超军.华中农业大学 2011
[10]黄颡鱼“裂头病”病原、病理及同工酶研究[D]. 陈飞鹏.河北农业大学 2010



本文编号：3722758