玉米根萤叶甲围食膜相关基因的分子特性及功能分析

发布时间：2023-01-30 19:50

　　玉米根萤叶甲Diabrotica virgiferavirgifera LeConte是一种世界性的重要玉米害虫,2007年被我国列入进境植物检疫性有害生物名录。随着玉米根萤叶甲抗药性的产生,寻找新的杀虫剂靶标位点成为防治玉米根萤叶甲的手段之一。研究玉米根萤叶甲围食膜,对于开发针对围食膜的杀虫剂进行害虫防治具有重要意义。目前玉米根萤叶甲的围食膜相关基因鲜有研究报道。本文成功克隆并分析了 7个玉米根萤叶甲围食膜相关基因的功能,对于寻找新的杀虫剂靶标位点和制定新的IPM策略具有重要的理论和实践意义。DvvCHS2是玉米根萤叶甲中肠几丁质合成酶2,参与中肠围食膜的几丁质合成。通过RACE-PCR,得到了 DvvCHS2的cDNA全长。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析发现,DvvCHS2在玉米根萤叶甲3龄幼虫和成虫时期表达量最高,且主要在中肠细胞中表达。dsCHS2对DvvCHS2的沉默效率很高,最高沉默效率可达90%。在取食dsCHS2后1天,成虫DvvCHS2表达量就会显著降低。成虫在取食dsCHS2后的6天内,生长正常,没有出现拒食和死亡。DvvCHS2基因沉默也没有导致成虫的毒... 

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 玉米根萤叶甲
        1.1 玉米根萤叶甲的形态特征
        1.2 玉米根萤叶甲的生活史
        1.3 玉米根萤叶甲的危害
        1.4 玉米根萤叶甲的防治
        1.5 玉米根萤叶甲传入我国的风险预测
    2 围食膜
        2.1 围食膜的功能
        2.2 围食膜的组成
    3 RNAi
        3.1 昆虫RNAi效率的研究
        3.2 RNAi在IPM上的应用
    4 本论文的研究目的及意义
第二章 玉米根萤叶甲几丁质合成酶Ⅱ基因DvvCHS2的分子特性及表达量分析
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 试剂(详见附录Ⅰ)
        1.3 玉米根萤叶甲成虫人工饲料制作
        1.4 主要仪器
        1.5 引物设计
        1.6 总RNA的提取与cDNA第一链合成
        1.7 PCR扩增、产物回收纯化、连接及转化
        1.8 克隆PCR和质粒提取
        1.9 不同发育时期、不同组织DvvCHS2表达量测定(荧光定量PCR)
    2 结果与分析
        2.1 玉米根萤叶甲成虫中肠形态
        2.2 玉米根萤叶甲DvvCHS2的cDNA序列及推导的蛋白序列
        2.3 几种昆虫CHS2的氨基酸序列对比
        2.4 昆虫CHS2的系统进化树分析
        2.5 不同组织DvvCHS2的表达量
        2.6 不同发育时期DvvCHS2的表达量
    3 讨论
第三章 玉米根萤叶甲几丁质合成酶Ⅱ基因DvvCHS2的功能分析
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 试剂(详见附录Ⅰ)
        1.3 玉米根萤叶甲成虫人工饲料制作
        1.4 主要仪器
        1.5 T7启动子引物设计
        1.6 总RNA的提取与cDNA第一链合成
        1.7 含有dsRNA模板DNA序列的质粒的合成
        1.8 dsRNA的合成
        1.9 dsRNA沉默效率实验设计
        1.10 生物测定
        1.11 DvvCHS2对药剂敏感度影响的实验
    2 结果与分析
        2.1 dsRNA的合成
        2.2 dsCHS2的沉默效率
        2.3 玉米根萤叶甲成虫对西维因和毒死蜱的敏感性
        2.4 沉默DvvCHS2后玉米根萤叶甲成虫对毒死蜱和西维因的敏感度变化
    3 讨论
第四章 玉米根萤叶甲中肠几丁质酶基因DvvMgCHT的分子特性及表达量分析
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 试剂(附录Ⅰ)
        1.3 玉米根萤叶甲成虫人工饲料制作
        1.4 主要仪器
        1.5 引物设计
        1.6 总RNA的提取与cDNA第一链合成
        1.7 PCR扩增、产物回收纯化、连接及转化
        1.8 克隆PCR和质粒提取
        1.9 不同发育时期、不同组织DvvMgCHT表达量测定(荧光定量PCR)
    2 结果与分析
        2.1 玉米根萤叶甲DvvMgCHT的cDNA序列及推导的蛋白序列
        2.2 几种昆虫CHT的氨基酸序列对比
        2.3 昆虫CHT的系统进化树分析
        2.4 不同组织DvvMgCHT的表达量
        2.5 不同发育时期DvvMgCHT的表达量
    3 讨论
第五章 玉米根萤叶甲中肠几丁质酶基因DvvMgCHT的功能分析
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 试剂(附录Ⅰ)
        1.3 玉米根萤叶甲成虫人工饲料制作
        1.4 主要仪器
        1.5 T7启动子引物设计
        1.6 总RNA的提取与cDNA第一链合成
        1.7 含有dsRNA模板DNA序列的质粒的合成
        1.8 dsRNA的合成
        1.9 dsRNA沉默效率实验设计
        1.10 DvvMgCHT对药剂敏感度影响的实验
    2 结果与分析
        2.1 dsMgCHT的沉默效率
        2.2 沉默DvvMgCHT后玉米根萤叶甲成虫对毒死蜱和西维因的敏感度变化
    3 讨论
第六章 玉米根萤叶甲围食膜因子基因DvvPMPs的分子特性及表达量分析
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 试剂(附录Ⅰ)
        1.3 玉米根萤叶甲成虫人工饲料制作
        1.4 主要仪器
        1.5 引物设计
        1.6 总RNA的提取与cDNA第一链合成
        1.7 PCR扩增、产物回收纯化、连接及转化
        1.8 克隆PCR和质粒提取
        1.9 不同发育时期、不同组织DvvPMPs表达量测定(荧光定量PCR)
    2 结果与分析
        2.1 玉米根萤叶甲DvvPMs的cDNA序列及推导的蛋白序列
        2.2 玉米根萤叶甲PMPs的氨基酸序列对比
        2.3 昆虫PMP的系统进化树分析
        2.4 不同组织DvvPMPs的表达量
        2.5 不同发育时期DvvPMPs的表达量
    3 讨论
第七章 玉米根萤叶甲围食膜因子基因DvvPMPs的功能分析
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 试剂(附录Ⅰ)
        1.3 玉米根萤叶甲成虫人工饲料制作
        1.4 主要仪器
        1.5 T7启动子引物设计
        1.6 总RNA的提取与cDNA第一链合成
        1.7 含有dsRNA模板DNA序列的质粒的合成
        1.8 dsRNA的合成
        1.9 dsRNA沉默效率实验设计
        1.10 DvvPMPs对药剂敏感度影响的实验
    2 结果与分析
        2.1 dsPMPs的沉默效率
        2.2 沉默DvvPMPs后玉米根萤叶甲成虫对毒死蜱和西维因的敏感度变化
    3 讨论
全文总结与展望
    1 总结
    2 本研究创新之处
    3 问题与展望
参考文献
致谢
附录Ⅰ 本论文所用试剂、试剂盒列表
附录Ⅱ 本论文荧光定量和dsRNA合成所用的引物
附录Ⅲ 本论文克隆的所有基因序列
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米根萤叶甲的抗逆性与防治研究进展[J]. 陈宏,Blair D.Siegfried,陈乃中,王音.  植物保护. 2009(06)
[2]玉米根萤叶甲在中国的潜在适生区域与检疫措施研究[J]. 张俊华,马菲,曹逸霞,黄习军,陈宏,陈乃中.  植物检疫. 2009(06)
[3]围食膜因子的分子结构及其功能[J]. 蔡秋月.  广西轻工业. 2007(06)
[4]警惕危险性害虫——玉米根萤叶甲传入我国[J]. 张丽杰,杨星科.  昆虫知识. 2002(02)



本文编号：3733387