TBK1基因敲除的Marc-145细胞株的构建及PRRSV繁殖状况的初步评价

发布时间：2024-09-17 17:04

　　猪繁殖与呼吸综合征严重危害着世界养猪业的健康发展。每年用于防控该病的疫苗投入,更是数额巨大。目前,PRRS疫苗多采用Marc-145细胞进行生产,增殖的病毒滴度直接影响疫苗的有效性和生产成本。而Marc-145细胞存在繁殖病毒滴度低的问题。TBK1基因是宿主抗病毒天然免疫信号通路的重要枢纽,对于细胞干扰素的产生具有重要影响。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建TBK1基因敲除的Marc-145细胞株,以期提升病毒的滴度。首先,本研究针对TBK1基因多个转录本的同源区设计了2对sgRNA,以pSpCas9(BB)-2A-puro(PX459)质粒为载体,将退火形成双链的sgRNA与BbsI酶切线性化的PX459质粒相连接,成功构建了PX459+sgRNA重组质粒。使用脂质体2000转染试剂将重组质粒转染至生长状态良好的Marc-145细胞中,通过嘌呤霉素筛选,获得了多克隆细胞。再将多克隆细胞经有限稀释后,培养至96孔细胞板重,5d后每天在显微镜下观察,挑选出单克隆细胞。经一轮Touchdown PCR鉴定、二轮Touchdown PCR扩增送测序鉴定。结果共筛选出了两株TBK1基因敲除...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图３?ＰＸ４５９＋ｓｇＲＮＡ单克隆菌落鉴定电泳图??Ｆｉｇ．?３：?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｍａｐ?ｏｆ?ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ?ｃｏｌｏｎｉｅｓ?ｏｆ?ＰＸ４５９＋ｓｇＲＮＡ．??

带是９１５３ｂｐ、下边条带２２ｂｐ太弱未??清晰显示），２：阴性对照、??Ｎｏｔｅ：?Ｍ：?ＤＬ２０００，?１：?ＰＸ４５９?ｐｌａｓｍｉｄ?ａｆｔｅｒ?＾．ｖｌ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?（Ｔｈｅ?ｕｐｐｅｒ?ｂａｎｄ?ｉｓ?９１５３?ｂｐ．?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｌｏｗｅｒ?ｓｔｒｉｐ?....

图５二轮Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ鉴定结果??Ｆｉｇ．?４：?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｓｅｃｏｎｄ?ｓｔｅｐ?Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ??—－??

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图６?２－２－１８细胞鉴定序列图??Ｆｉｇ．?６?Ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?２－２－１８?ｃｅｌｌｓ??

ｐｌｅ?ｓｃｒｅｅｎｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｆｉｒｓｔ?ｓｔｅｐ．??３．４细胞基因测序结果??一．轮Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ扩增出的条带，切胶１１１］收）Ｈ＇、送金唯智公司测印，将测得的序列??结果与ＮＣＢＩ公布的ＴＢＫ１基因该位置的序列进行比，结果显示：２－２－１８细胞?＇....

图７?１－３－Ａ细胞鉴定序列图??Ｆｉｇ．?７?Ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?１－３－Ａ?ｃｅｌｌｓ??

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本文编号：4005765