多花黄精离体培养条件优化及生长发育基因克隆与表达分析

发布时间：2023-02-13 18:49

　　多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum Mill.)多年生草本植物,集药用、食用、美容和观赏价值于一身,具有广阔的开发利用前景。多花黄精根状茎主要含多糖、黄酮、蒽醌、薯蓣皂苷、木脂素及对人体有用的多种氨基酸等,性平、味甘,具有滋阴润肺、提高人体免疫力、补中益气的作用和功效,是为滋补上品。但由于多花黄精生长周期长,种子繁殖需要5年以上,根状茎繁殖也至少需要3年,传统的无性繁育技术不仅使黄精优良性状难以保存,而且繁殖效率较低,极大地限制了黄精的规模化扩繁。近年来随着人们对黄精的需求量与日俱增,野生资源已远远不能满足生产的需要,工厂化生产势在必行。植物组织培养技术不仅可以很好地保存黄精的优良性状,而且还可以消除了季节等外在因素的影响,从而在可控的环境下显著提高增殖系数。因此,本研究以多花黄精为材料,对多花黄精进行无菌体系的建立,并诱导不定芽的生长,优化离体培养条件,再对优化后的材料进行甾体皂苷的测定,同时克隆得到多花黄精PcCIGR和PcSCL21基因的cDNA、gDNA全长序列,分析PcCIGR和PcSCL...

【文章页数】：123 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 引言
    1 黄精属植物离体培养无菌体系的研究进展
    2 多花黄精离体培养条件的优化及不定芽增殖研究进展
    3 薯蓣皂苷的研究进展
        3.1 薯蓣皂苷提取的研究进展
        3.2 薯蓣皂苷测定的研究进展
    4 多花黄精生长发育相关基因的研究进展
        4.1 CIGR基因的研究进展
        4.2 SCL21 基因的研究进展
    5 本研究意义和主要内容
        5.1 研究意义
        5.2 研究内容
第二章 野生黄精无菌体系的建立
    第一节 外植体预处理对黄精无菌体系建立的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
        3 讨论
    第二节 不同消毒试剂配比对无菌体系建立的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
            1.3 培养条件
        2 结果与分析
            2.1 乙醇与次氯酸钠不同时间配合处理对外植体的影响
            2.2 乙醇与氯化汞不同时间配合处理对外植体的影响
        3 讨论
    第三节 取材时间和激素配比对黄精不定芽诱导的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 取材时间对野生黄精不定芽诱导的影响
                1.2.2 激素配比对野生黄精不定芽诱导的影响
        2 结果与分析
            2.1 不同取材时间对不定芽诱导的影响
            2.2 不同激素配比对不定芽诱导的影响
        3 讨论
第三章 多花黄精离体培养条件优化及不定芽的增殖
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
            1.2.1 不同光质对多花黄精的处理
            1.2.2 不同光周期对多花黄精的处理
            1.2.3 不同激素配比对多花黄精的处理
        1.3 培养条件
        1.4 数据处理
    2 结果与分析
        2.1 光周期对多花黄精不定芽增殖的影响
        2.2 光质对多花黄精不定芽增殖的影响
        2.3 激素配比对多花黄精不定芽增殖的影响
    3 讨论
第四章 光与激素处理下多花黄精根状茎中薯蓣皂苷含量的影响
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 材料与试剂
            1.1.2 仪器与设备
        1.2 方法
            1.2.1 标准溶液的配制
            1.2.2 样品预处理
            1.2.3 色谱条件
        1.3 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 HPLC分析方法的建立
            2.1.1 柱温和流动相的选择
            2.1.2 样品处理方法的优化
        2.2 HPLC分析方法的考察
            2.2.1 线性范围和检出限
            2.2.2 精密度试验
            2.2.3 重复性试验
            2.2.4 稳定性试验
            2.2.5 加样回收率试验
        2.3 光处理下多花黄精根状茎中薯蓣皂苷含量的影响
        2.4 激素处理下多花黄精根状茎中薯蓣皂苷含量的影响
        2.5 培养天数对多花黄精根状茎中薯蓣皂苷含量的影响
    3 讨论
第五章 多花黄精CIGR基因克隆、亚细胞定位及其生物信息学及表达分析
    第一节 多花黄精CIGR基因克隆及其生物信息学分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 CIGR基因的筛选与克隆
                1.2.2 总DNA、RNA的提取及c DNA的合成
                1.2.3 多花黄精g DNA克隆
                1.2.4 生物信息学分析
        2 结果与分析
            2.1 多花黄精CIGR基因c DNA及 g DNA的获得及结构
            2.2 CIGR基因基本理化性质分析
            2.3 CIGR聚类分析
            2.4 CIGR蛋白保守结构域分析
        3 讨论
    第二节 多花黄精CIGR基因的亚细胞定位分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 总RNA的提取与c DNA合成
                1.2.2 CIGR基因序列酶切位点预测与分析
                1.2.3 CIGR亚细胞定位载体构建引物设计
                1.2.4 目的片段的获得
                1.2.5 提取重组质粒
                1.2.6 载体的酶切与重组载体的构建
                1.2.7 重组质粒转入农杆菌感受态细胞EHA105
                1.2.8 农杆菌侵染受体(多花黄精叶片、洋葱内表皮)
                1.2.9 激光显微共聚焦显微镜观察GFP信号
        2 结果与分析
            2.1 重组载体的构建与鉴定
            2.2 多花黄精CIGR蛋白的亚细胞定位
        3 讨论
    第三节 黄精CIGR基因在不同组织部位的表达分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 试验试剂及仪器
            1.3 方法
                1.3.1 黄精总RNA的提取及c DNA合成
                1.3.2 实时荧光定量PCR引物设计与扩增程序
            1.4 数据分析
        2 结果与分析
        3 讨论
    第四节 黄精CIGR基因在不同光、激素和培养天数处理下的表达分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 试验试剂及仪器
            1.3 方法
                1.3.1 试验材料的处理
                1.3.2 黄精总RNA的提取及c DNA合成
                1.3.3 实时荧光定量PCR引物设计与扩增程序
            1.4 数据分析
        2 结果与分析
            2.1 在不同光质和光周期处理下多花黄精CIGR的表达分析
            2.2 在不同激素处理下多花黄精CIGR的表达分析
            2.3 在不同培养天数下多花黄精CIGR基因的表达分析
        3 讨论
第六章 多花黄精SCL21 基因克隆、生物信息学及表达分析
    第一节 多花黄精SCL21 基因克隆、生物信息学分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 SCL21 基因的克隆
                1.2.2 总DNA、RNA的提取及c DNA的合成
                1.2.3 多花黄精g DNA克隆
                1.2.4 PCR扩增体系及程序
                1.2.5 目的片段回收、克隆转化与测序
                1.2.6 黄精SCL21 生物信息学分析
        2 结果与分析
            2.1 多花黄精SCL21 基因ORF的验证
            2.2 多花黄精总RNA的提取与质量检测
            2.3 多花黄精g DNA的克隆
            2.4 多花黄精SCL21 蛋白同源性分析
            2.5 多花黄精SCL21 蛋白理化性质分析
            2.6 多花黄精SCL21 基因结构分析
            2.7 多花黄精SCL21 蛋白保守结构域分析
            2.8 多花黄精SCL21 蛋白的亚细胞定位与信号肽预测
            2.9 多花黄精SCL21 跨膜结构与磷酸位点预测
            2.10 多花黄精SCL21 蛋白蜷曲螺旋结构的分析
            2.11 多花黄精SCL21 蛋白二级结构分析与三维结构预测
            2.12 SCL21 蛋白motif分析
            2.13 SCL21 系统进化树分析
            2.14 多花黄精SCL21 蛋白互作关系分析
        3 讨论
    第二节 多花黄精SCL21 基因的表达模式分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 多花黄精总RNA的提取及c DNA的合成
                1.2.2 荧光定量PCR分析
                1.2.3 试验材料的处理
            1.3 数据分析
        2 结果与分析
            2.1 多花黄精总RNA的提取及质量检测
            2.2 SCL21 基因在多花黄精不同组织部位中的表达模式分析
            2.3 多花黄精SCL21 在光质与光周期处理下的表达情况
            2.4 多花黄精SCL21 基因在激素处理下的表达情况
            2.5 多花黄精SCL21 基因在不同培养天数下的表达情况
        3 讨论
第七章 小结与展望
    1 小结
        1.1 多花黄精无菌体系的建立
        1.2 多花黄精离体培养条件的优化及不定芽增殖
        1.3 HPLC法测定多花黄精根状茎中薯蓣皂苷
        1.4 多花黄精CIGR基因克隆、生物信息学及表达分析
        1.5 多花黄精SCL21 基因克隆、生物信息学及表达分析
    2 展望
参考文献
附录 A 图例及图版说明
附录 B 本研究使用的基因序列
攻读硕士学位期间发表的论文情况
致谢



本文编号：3742116