水稻黄叶候选基因的功能研究

发布时间：2023-02-18 12:15

　　叶绿体的正常发育对于植物生长至关重要。叶色突变体的研究是探明叶绿体发育过程中基因功能的有效途径。近年来,叶色突变相关基因的研究已取得较好进展,对水稻叶色突变体的报道主要包括黄化、白化、亮绿、条斑条纹、温敏变色、转绿和转紫等。在前期的研究中,用⁶⁰Co-γ射线辐射的籼稻9311后代中筛选到一个黄叶突变体。以黄叶突变体和野生型为材料,结合重测序、图位克隆技术和转录组测序技术,在图位克隆定位的区间内筛选到13个差异表达的基因,为了进一步确定各个基因是否与黄叶突变有关,本研究开展的工作及其结果如下:1.利用CRISPR/Cas9系统构建水稻黄叶突变体候选基因的编辑载体及其遗传转化。利用黄叶候选基因的外显子区域2个不同靶位点序列设计合成特异引物,构建了13个候选基因的pC1300-Cas9编辑载体。将构建成功的载体,通过农杆菌介导的方式遗传转化水稻品种日本晴,而BGIOSGA012976和BGIOSGA010427的基因编辑载体同时转化9311品种。除了BGIOSGA010427(受体9311)、BGIOSGA010449、BGIOSGA012911、BGIOSGA0129...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 文章综述
    1.1 叶色形成研究进展
        1.1.1 叶色突变的来源及分类
        1.1.2 叶绿体合成途径
        1.1.3 叶绿体降解途径
        1.1.4 水稻叶色突变相关基因的研究进展
        1.1.5 水稻叶色突变的研究意义及应用
    1.2 CRISPR/Cas9 概述
    1.3 RNA干涉概述
    1.4 本研究的主要内容、目的及意义
第二章 水稻黄叶候选基因敲除载体的构建及遗传转化
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验菌株和载体
        2.2.3 实验试剂
        2.2.4 实验主要试剂配方
    2.3 实验方法
        2.3.1 基因的生物信息学分析
        2.3.2 基因编辑目的序列的选择
        2.3.3 SK-gRNA重组载体构建
        2.3.4 pC1300-Cas9-12976 重组载体构建及阳性鉴定
        2.3.5 pC1300-Cas9-12976 重组载体电击转化农杆菌及阳性鉴定
        2.3.6 根癌农杆菌EHA105 介导的pC1300-Cas9 重组载体的水稻遗传转化
        2.3.7 转基因T0代植株的阳性鉴定
        2.3.8 转基因阳性植株中黄叶突变候选基因编辑检测
        2.3.9 T0-Cas9-12976 转基因植株的表型观察
    2.4 实验结果与分析
        2.4.1 生物信息学分析结果
        2.4.2 靶序列选择及引物设计
        2.4.3 SK-gRNA-12976 重组载体构建及阳性鉴定
        2.4.4 pC1300-Cas12976 重组载体构建及阳性鉴定
        2.4.5 pC1300-Cas9-12976 重组载体农杆菌电击转化及阳性鉴定
        2.4.6 基因编辑载体的遗传转化
        2.4.7 T0转基因植株的阳性鉴定
        2.4.8 转基因植株中靶基因的检测
        2.4.9 T0-Cas9-12976 转基因植株的表型观察
    2.5 讨论
第三章 两个水稻黄叶候选基因RNA干涉表达载体及遗传转化
    3.1 引言
    3.2 材料及方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验试剂
        3.2.3 实验菌株与载体
        3.2.4 实验主要试剂配方
        3.2.5 实验仪器与设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 RNAi引物的设计
        3.3.2 9311总RNA的提取及RNA反转
        3.3.3 干涉表达载体的构建
        3.3.4 RNAi表达载体转入农杆菌
        3.3.5 RNAi表达载体的遗传转化
    3.4 实验结果与分析
        3.4.1 9311cDNA Actin检测
        3.4.2 目的基因第一链与DS1301 的组装
        3.4.3 目的基因第二链与重组载体DS1301 的组装
        3.4.4 RNA干涉表达载体的农杆菌转化
        3.4.5 RNA干涉表达载体的水稻遗传转化
        3.4.6 RNA干涉表达载体的转基因植株阳性鉴定及表型观察
    3.5 讨论
第四章 两个水稻黄叶候选基因超表达载体的构建及遗传转化
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验菌株和载体
        4.2.3 实验试剂
        4.2.4 实验主要试剂配方
        4.2.5 实验主要仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 超表达载体引物的设计
        4.3.2 9311RNA的提取及RNA反转
        4.3.3 超表达载体的构建
        4.3.4 超表达载体的农杆菌电击转化
        4.3.5 超表达载体的水稻遗传转化
    4.4 实验结果
        4.4.1 目的基因的扩增
        4.4.2 TA克隆阳性鉴定
        4.4.3 TA重组载体和pCAMBIA1302 载体质粒DNA的酶切
        4.4.4 阳性克隆鉴定
        4.4.5 超表达载体的农杆菌电击转化
        4.4.6 超表达载体的遗传转化
    4.5 讨论
致谢
参考文献
在读期间发表的学术论文
参与的学术会议



本文编号：3744949