TBC1D8B基因功能研究和互作蛋白的鉴定

发布时间：2023-02-19 16:40

　　TBC结构域蛋白家族是一类真核生物中普遍存在、保守性高、GTP酶激活蛋白。在人类基因组预测编码中大约有40多种TBC结构域蛋白成员。TBC家族蛋白结构中具有大约200氨基酸残基组成的保守性蛋白结构域,包括一个GTPase激活活性结构,可以特异性识别RAB-GTP形式将其水解为GDP形式;其结构域还与细胞膜功能相关的结构域串联在一起组成蛋白质,如PTB(phosphotyrosine-binding domain)、PH(pleckstrin homology domain)、CC(coiled-coil)或者GRAM(gucosyl transferases)结构域等,其生物学功能与细胞膜紧密相关。该蛋白家族已发现与癌症的发生发展密切关联。尽管该家族中部分成员其功能和作用靶标蛋白有所研究,但是与骨质疏松症和儿童期崩解性疾病(CDD)相关TBC1D8B作为TBC结构域家族蛋白之一,对其功能和作用靶标都有待于研究。基于以上研究背景,本文利用生物信息学分析、以及形态学研究、蛋白共定位、酵母双杂交等一系列功能实验,对TBCLD8B的功能及其作用机制进行探究,本文研究的主要结果包括:1.TBC1...

【文章页数】：106 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
第一章 绪论
    1. TBC结构域蛋白家族
        1.1 TBC结构域蛋白家族简介
        1.2 TBC结构域蛋白家族结构特征
    2. TBC结构域蛋白家族与疾病
    3. Rab蛋白
    4. 本文研究的主要内容和主要贡献
第二章 TBC1D8B会影响线粒体的分布及在突触的运输
    1. 前言
    2. 实验材料
        2.1 实验菌株、细胞株和质粒
            2.1.1 实验菌株
            2.1.2 实验细胞株
            2.1.3 质粒
        2.2 常用的培养基与缓冲液配方
        2.3 主要仪器设备
        2.4 主要试剂和试剂盒
    3. 实验方法
        3.1 细胞的复苏、传代和冻存
            3.1.1 细胞复苏
            3.1.2 细胞传代
            3.1.3 细胞冻存
        3.2 RNA的提取和CDNA的获取
            3.2.1 RNA提取
            3.2.2 反转录
        3.3 载体的构建
        3.4 去内毒素质粒提取
        3.5 细胞转染
        3.6 Mito染色封片
        3.7 免疫荧光
    4. 实验结果
        4.1 TBC1D8B可以部分定位带线粒体上
            4.1.1 TBC1D8B-pEGFP-N2质粒构建
            4.1.2 TBC1D8B-pEGFP-N2重组质粒转染转染和线粒体染色
        4.2 TBC1D8B会影响线粒体的分布和运输
    5. 本章小结
第三章 与TBC1D8B的RAB底物和互作蛋白的筛选
    1. 研究目的
    2. 实验材料
        2.1 实验菌株、细胞株和质粒
            2.1.1 实验菌株
            2.1.2 实验细胞株
            2.1.3 质粒
        2.2 常用的培养基与缓冲液配方
        2.3 主要仪器设备
        2.4 主要试剂和试剂盒
    3. 实验方法
        3.1 细胞的复苏、传代和冻存
        3.2 载体的构建
        3.3 去内毒素质粒提取
        3.4 细胞转染
        3.5 点突变
        3.6 酵母双杂交
    4. 实验结果
        4.1 共定位载体的构建
        4.2 荧光共定位
        4.3 酵母双杂交
    5. 本章小结
第四章 TBC1D8B过表达促进细胞增殖、迁移和浸润能力
    1. 研究目的
    2. 实验材料
        2.1 实验菌株、细胞株和质粒
        2.2 常用的培养基与缓冲液配方
        2.3 主要仪器设备
        2.4 主要试剂和试剂盒
    3. 实验方法
        3.1 细胞的复苏、传代和冻存
        3.2 载体的构建
        3.3 TBC1D8B-pCMV-Tag3C稳定表达株的筛选
            3.3.1 确定单克隆筛选的G418浓度
            3.3.2 稳定表达株的筛选
        3.4. 蛋白的提取和Western Blot
        3.5 酵母双杂交
        3.6 MTT法检测细胞增殖
        3.7 划痕愈合实验
        3.8 Transwell实验
    4. 实验结果
        4.1 异常RHOT1和RHOT2转录本
        4.2 TBC1D8B过表达影响细胞形态
            4.2.1 TBC1D8B-pCMV-Tag3C载体的构建
            4.2.2 TBC1D8B过表达株的筛选
        4.3 TBC1D8B过表达使细胞增殖速度加快
        4.4 TBC1D8B过表达会影响细胞的迁移和浸润
    5. 本章小结
全文总结与展望
    TBC1D8B过表达会影响神经细胞形态及线粒体的运输
    TBC1D8B过表达会促进细胞的增殖,迁移和浸润的能力
附录一 RHOT1新转录本与最接近转录本对比
附录二 载体图谱
常用的网上数据库和生物学资源
    1. 常用文献资源搜索网站
    2. 常用生物学资源网站
参考文献
致谢



本文编号：3746578