二球悬铃木花发育基因PaAP3、PaPI和PaSTK启动子的克
发布时间：2023-02-19 18:37
二球悬铃木(Platanus acerifolia)是我国城市绿化中最为重要的物种之一。其冠大荫浓、生长迅速、适应性较强、具有净化空气的能力,被人们称之为行道树之王。二球悬铃木被广泛种植于全球的各个城市,在园林建设中占据不可替代的作用。然而,二球悬铃木果实成熟之后裂果所带来的毛絮,严重影响到了城市的环境和人们的身心健康。近些年来,有很多的科研工作者在突变育种、枝条修剪等方面做了很多的研究,但都没能从根本上解决二球悬铃木落果飞毛的问题。随着植物分子生物学技术的发展,尤其是在利用基因工程创造不育植株中取得了很大的突破,为培育无球二球悬铃木带来了新的希望。自ABC模型提出以来,研究人员对花器官发育的基因调控网络做了深入分析,使花发育相关的研究从形态描述及生理层次,深入到了分子调节水平。随着对二球悬铃木开花相关基因的克隆,对其成花机理的了解也越来越透彻。深入了解这些花器官形成基因的调控机理,可以更好地将这些遗传资源应用到二球悬铃木等园林植物的育种中。本课题以二球悬铃木为实验材料,采用了TAIL-PCR的方法分离了二球悬铃木中花发育B类两个基因的启动子序列,采用生物信息、启动子截短、GUS蛋白染...
【文章页数】：134 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 植物花发育相关基因的研究进展
1.1.1 植物花发育的模型
1.1.2 同源异型框B类基因
1.1.3 同源异型框D类基因
1.1.4 二球悬铃木中花器官同源异型基因相关研究
1.2 真核生物启动子研究进展
1.2.1 真核生物启动子组成
1.2.2 启动子的顺式元件
1.2.3 植物启动子的类型
1.2.3.1 组成型启动子
1.2.3.2 诱导型启动子
1.2.3.3 组织特异性启动子
1.2.4 启动子克隆方法
1.2.4.1 启动子探针筛选基因组
1.2.4.2 启动子捕获
1.2.4.3 反向PCR
1.2.4.4 热不对称交错PCR
1.2.5 启动子研究策略
1.2.5.1 生物信息学对启动子进行预测分析
1.2.5.2 组织化学染色及荧光分析
1.2.5.3 缺失分析
1.2.5.4 凝胶阻滞试验
1.2.5.5 酵母单杂交技术
1.2.5.6 染色质免疫共沉淀法
1.2.5.7 定点突变分析
1.3 BARNASE基因研究及应用
1.3.1 BARNASE基因的分离及活性分析
1.3.2 BARNASE基因的在植物基因工程中的应用
1.4 本课题的研究目的和意义
第二章 二球悬铃木B类基因AP3启动子的克隆及其功能分析
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 植物材料
2.2.2 菌株、载体和感受态细胞
2.2.3 主要试剂与药品
2.2.4 实验引物
2.2.5 实验方法
2.2.5.1 启动子pPaAP3的分离克隆
2.2.5.2 生物信息学对启动子进行预测分析
2.2.5.3 启动子pPaAP3及系列 5’缺失表达载体构建
2.2.5.4 根瘤农杆菌介导的烟草遗传转化
2.2.5.5 转基因烟草植株阳性检测
2.2.5.6 GUS蛋白组织化学染色
2.2.5.7 RNA的抽提
2.2.5.8 RT-PCR检测
2.3 结果与分析
2.3.1 启动子pPaAP3的克隆及序列分析
2.3.2 启动子pPaAP3不同缺失片段表达的载体构建
2.3.3 转基因烟草的阳性检测
2.3.4 组织化学染色分析启动子各缺失片段的表达模式
2.3.5 RT-PCR检测GUS基因在转基因烟草中的表达模式
2.4 讨论
第三章 二球悬铃木B类基因PI启动子的克隆及其功能分析
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 植物材料
3.2.2 菌株、载体和感受态细胞
3.2.3 主要试剂与药品
3.2.4 主要实验方法
3.2.4.1 启动子pPaPI的分离克隆
3.2.4.2 生物信息学对启动子进行预测分析
3.2.4.3 启动子pPaPI及系列 5’缺失表达载体构建
3.2.4.4 农杆菌介导的烟草遗传转化和阳性检测
3.2.4.5 GUS蛋白染色和RNA抽提等方法
3.3 结果与分析
3.3.1 启动子pPaPI的克隆及序列分析
3.3.2 启动子pPaPI不同缺失片段表达的载体构建
3.3.3 转基因烟草的阳性检测
3.3.4 组织化学染色分析启动子各缺失片段的表达模式
3.3.5 RT-PCR检测GUS基因在转基因烟草中的表达模式
3.4 讨论
第四章 二球悬铃木B类基因PaAP3和PaPI组织特异性启动子在不育植株构建中的应用
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验材料和试剂
4.2.2 实验方法
4.2.2.1 启动子表达载体pPaAP3-p8::BARNASE和pPaPI-p5::BARNASE的构建
4.2.2.2 根瘤农杆菌介导的烟草的遗传转化及阳性转基因植株检测
4.2.2.3 转基因烟草表型植株RT-PCR检测
4.3 结果与分析
4.3.1 表达载体pPaAP3-p8::BARNASE和pPaPI-p5::BARNASE的构建
4.3.2 表达载体pPaAP3-p8::BARNASE转基因烟草的表型观测
4.3.3 表达载体pPaPI-p5::BARNASE转基因烟草的表型观测
4.3.4 转基因烟草表型植株RT-PCR检测
4.4 讨论
4.4.1 表达载体pPaAP3-p8::BARNASE、pPaPI-p5::BARNASE转基因烟草的表型比较
4.4.2 表达载体pPaAP3-p8::BARNASE和pPaPI-p5::BARNASE的功能分析及应用
第五章 二球悬铃木D类基因PaSTK的同源克隆与表达分析
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验材料和试剂
5.2.2 实验方法
5.2.2.1 PaSTK核心保守片段同源扩增
5.2.2.2 采用TAIL-PCR结合 3’ RACE克隆PaSTK基因全长
5.2.2.3 基于二球悬铃木PaSTK基因编码区构建系统树
5.2.2.4 荧光定量检测PaSTK在二球悬铃木各组织中的表达模式
5.3 结果与分析
5.3.1 PaSTK基因核心保守片段扩增及同源比对
5.3.2 PaSTK基因全长结构域分析
5.3.3 基于二球悬铃木PaSTK基因编码区的进化树构建
5.3.4 荧光定量检测PaSTK在二球悬铃木各组织中的表达模式
5.4 讨论
第六章 二球悬铃木D类基因PaSTK启动子的克隆、功能分析及其在不育植物构建中的应用
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 植物材料
6.2.2 菌株、载体和感受态细胞
6.2.3 主要试剂与药品
6.2.4 实验方法
6.2.4.1 启动子pPaSTK的分离克隆
6.2.4.2 生物信息学对启动子进行预测分析
6.2.4.3 启动子表达载体pPaSTK::GUS表达载体的构建
6.2.4.4 启动子表达载体PaSTK::BARNASE的构建
6.2.4.5 拟南芥的遗传转化及阳性转基因植株检测
6.2.4.6 考马斯亮蓝法测定pPaSTK::GUS转基因拟南芥GUS蛋白活性
6.2.4.7 PaSTK::BARNASE转基因拟南芥表型植株RT-PCR检测
6.3 结果与分析
6.3.1 启动子pPaSTK的克隆及序列分析
6.3.2 启动子表达载体pPaSTK::GUS的构建
6.3.3 PaSTK::GUS转基因拟南芥的阳性检测
6.3.4 考马斯亮蓝法测定pPaSTK::GUS转基因拟南芥GUS蛋白活性
6.3.5 表达载体pPaSTK::BARNASE的构建
6.3.6 表达载体pPaSTK::BARNASE转基因拟南芥植株RT-PCR检测
6.3.7 表达载体pPaSTK::BARNASE转基因拟南芥的表型观测
6.4 讨论
第七章 总结与展望
7.1 总结
7.1.1 启动子的克隆策略
7.1.2 启动子的研究策略
7.1.3 二球悬铃木启动子pPaAP3的特征及应用
7.1.4 二球悬铃木启动子pPaPI的特征及应用
7.1.5 二球悬铃木启动子pPaSTK的特征及应用
7.1.6 二球悬铃木落果飞毛问题的改良
7.1.7 二球悬铃木遗传转化研究
7.2 展望
参考文献
附录A 改良的CTAB法提取基因组DNA
附录B 碱裂解法提取质粒DNA（小量法）
附录C 大肠杆菌热激感受态的制备及热激法转化
附录D 农杆菌电转感受态的制备及电转化步骤
附录E 农杆菌介导的烟草遗传转化
附录F 烟草、拟南芥总RNA的提取
附录G mRNA反转录cDNA步骤
附录H 考马斯亮蓝法测定GUS蛋白活性
附录I GENBANK注册基因登录号
附录J PaSTK同源基因列表
博士在读期间已发表文章
致谢
本文编号：3746746
【文章页数】：134 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 植物花发育相关基因的研究进展
1.1.1 植物花发育的模型
1.1.2 同源异型框B类基因
1.1.3 同源异型框D类基因
1.1.4 二球悬铃木中花器官同源异型基因相关研究
1.2 真核生物启动子研究进展
1.2.1 真核生物启动子组成
1.2.2 启动子的顺式元件
1.2.3 植物启动子的类型
1.2.3.1 组成型启动子
1.2.3.2 诱导型启动子
1.2.3.3 组织特异性启动子
1.2.4 启动子克隆方法
1.2.4.1 启动子探针筛选基因组
1.2.4.2 启动子捕获
1.2.4.3 反向PCR
1.2.4.4 热不对称交错PCR
1.2.5 启动子研究策略
1.2.5.1 生物信息学对启动子进行预测分析
1.2.5.2 组织化学染色及荧光分析
1.2.5.3 缺失分析
1.2.5.4 凝胶阻滞试验
1.2.5.5 酵母单杂交技术
1.2.5.6 染色质免疫共沉淀法
1.2.5.7 定点突变分析
1.3 BARNASE基因研究及应用
1.3.1 BARNASE基因的分离及活性分析
1.3.2 BARNASE基因的在植物基因工程中的应用
1.4 本课题的研究目的和意义
第二章 二球悬铃木B类基因AP3启动子的克隆及其功能分析
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 植物材料
2.2.2 菌株、载体和感受态细胞
2.2.3 主要试剂与药品
2.2.4 实验引物
2.2.5 实验方法
2.2.5.1 启动子pPaAP3的分离克隆
2.2.5.2 生物信息学对启动子进行预测分析
2.2.5.3 启动子pPaAP3及系列 5’缺失表达载体构建
2.2.5.4 根瘤农杆菌介导的烟草遗传转化
2.2.5.5 转基因烟草植株阳性检测
2.2.5.6 GUS蛋白组织化学染色
2.2.5.7 RNA的抽提
2.2.5.8 RT-PCR检测
2.3 结果与分析
2.3.1 启动子pPaAP3的克隆及序列分析
2.3.2 启动子pPaAP3不同缺失片段表达的载体构建
2.3.3 转基因烟草的阳性检测
2.3.4 组织化学染色分析启动子各缺失片段的表达模式
2.3.5 RT-PCR检测GUS基因在转基因烟草中的表达模式
2.4 讨论
第三章 二球悬铃木B类基因PI启动子的克隆及其功能分析
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 植物材料
3.2.2 菌株、载体和感受态细胞
3.2.3 主要试剂与药品
3.2.4 主要实验方法
3.2.4.1 启动子pPaPI的分离克隆
3.2.4.2 生物信息学对启动子进行预测分析
3.2.4.3 启动子pPaPI及系列 5’缺失表达载体构建
3.2.4.4 农杆菌介导的烟草遗传转化和阳性检测
3.2.4.5 GUS蛋白染色和RNA抽提等方法
3.3 结果与分析
3.3.1 启动子pPaPI的克隆及序列分析
3.3.2 启动子pPaPI不同缺失片段表达的载体构建
3.3.3 转基因烟草的阳性检测
3.3.4 组织化学染色分析启动子各缺失片段的表达模式
3.3.5 RT-PCR检测GUS基因在转基因烟草中的表达模式
3.4 讨论
第四章 二球悬铃木B类基因PaAP3和PaPI组织特异性启动子在不育植株构建中的应用
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验材料和试剂
4.2.2 实验方法
4.2.2.1 启动子表达载体pPaAP3-p8::BARNASE和pPaPI-p5::BARNASE的构建
4.2.2.2 根瘤农杆菌介导的烟草的遗传转化及阳性转基因植株检测
4.2.2.3 转基因烟草表型植株RT-PCR检测
4.3 结果与分析
4.3.1 表达载体pPaAP3-p8::BARNASE和pPaPI-p5::BARNASE的构建
4.3.2 表达载体pPaAP3-p8::BARNASE转基因烟草的表型观测
4.3.3 表达载体pPaPI-p5::BARNASE转基因烟草的表型观测
4.3.4 转基因烟草表型植株RT-PCR检测
4.4 讨论
4.4.1 表达载体pPaAP3-p8::BARNASE、pPaPI-p5::BARNASE转基因烟草的表型比较
4.4.2 表达载体pPaAP3-p8::BARNASE和pPaPI-p5::BARNASE的功能分析及应用
第五章 二球悬铃木D类基因PaSTK的同源克隆与表达分析
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验材料和试剂
5.2.2 实验方法
5.2.2.1 PaSTK核心保守片段同源扩增
5.2.2.2 采用TAIL-PCR结合 3’ RACE克隆PaSTK基因全长
5.2.2.3 基于二球悬铃木PaSTK基因编码区构建系统树
5.2.2.4 荧光定量检测PaSTK在二球悬铃木各组织中的表达模式
5.3 结果与分析
5.3.1 PaSTK基因核心保守片段扩增及同源比对
5.3.2 PaSTK基因全长结构域分析
5.3.3 基于二球悬铃木PaSTK基因编码区的进化树构建
5.3.4 荧光定量检测PaSTK在二球悬铃木各组织中的表达模式
5.4 讨论
第六章 二球悬铃木D类基因PaSTK启动子的克隆、功能分析及其在不育植物构建中的应用
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 植物材料
6.2.2 菌株、载体和感受态细胞
6.2.3 主要试剂与药品
6.2.4 实验方法
6.2.4.1 启动子pPaSTK的分离克隆
6.2.4.2 生物信息学对启动子进行预测分析
6.2.4.3 启动子表达载体pPaSTK::GUS表达载体的构建
6.2.4.4 启动子表达载体PaSTK::BARNASE的构建
6.2.4.5 拟南芥的遗传转化及阳性转基因植株检测
6.2.4.6 考马斯亮蓝法测定pPaSTK::GUS转基因拟南芥GUS蛋白活性
6.2.4.7 PaSTK::BARNASE转基因拟南芥表型植株RT-PCR检测
6.3 结果与分析
6.3.1 启动子pPaSTK的克隆及序列分析
6.3.2 启动子表达载体pPaSTK::GUS的构建
6.3.3 PaSTK::GUS转基因拟南芥的阳性检测
6.3.4 考马斯亮蓝法测定pPaSTK::GUS转基因拟南芥GUS蛋白活性
6.3.5 表达载体pPaSTK::BARNASE的构建
6.3.6 表达载体pPaSTK::BARNASE转基因拟南芥植株RT-PCR检测
6.3.7 表达载体pPaSTK::BARNASE转基因拟南芥的表型观测
6.4 讨论
第七章 总结与展望
7.1 总结
7.1.1 启动子的克隆策略
7.1.2 启动子的研究策略
7.1.3 二球悬铃木启动子pPaAP3的特征及应用
7.1.4 二球悬铃木启动子pPaPI的特征及应用
7.1.5 二球悬铃木启动子pPaSTK的特征及应用
7.1.6 二球悬铃木落果飞毛问题的改良
7.1.7 二球悬铃木遗传转化研究
7.2 展望
参考文献
附录A 改良的CTAB法提取基因组DNA
附录B 碱裂解法提取质粒DNA（小量法）
附录C 大肠杆菌热激感受态的制备及热激法转化
附录D 农杆菌电转感受态的制备及电转化步骤
附录E 农杆菌介导的烟草遗传转化
附录F 烟草、拟南芥总RNA的提取
附录G mRNA反转录cDNA步骤
附录H 考马斯亮蓝法测定GUS蛋白活性
附录I GENBANK注册基因登录号
附录J PaSTK同源基因列表
博士在读期间已发表文章
致谢
本文编号：3746746
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