贵州地区苏云金芽胞杆菌杀虫新基因的挖掘与功能验证

发布时间：2023-02-23 07:48

　　苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)自从被发现至今已被广泛的应用于农业生产、森林保护、园林防治以及卫生害虫的防治。目前,越来越多的Bt制剂和Bt作物得到了广泛的开发和应用,在防治害虫方面取得了良好的防治效果。自20世纪20年代以来,Bt蛋白就已经用于农业害虫的防治,并取得了上佳的效果。因此,分离筛选高效、广谱杀虫活性的Bt菌株,克隆新的杀虫活性基因,为生产实践防病治虫提供新的资源。本研究通过广泛采取收集贵州地区土壤腐殖质,以此分离筛选了一批Bt菌株,并对其进行基因型鉴定、杀虫活性分析,得到一批鳞翅目害虫具有杀虫活性的Bt菌株,并从CS137-2和CS72-1两个菌株中克隆得到3个新的Bt基因。对贵州多个地区共收集1170份样品进行芽胞杆菌抗生素分离处理,总共获得976株芽胞杆菌,鉴定出181株Bt菌,平均分离率超过了18%。对得到这的一百多株Bt菌进行基因型分析,发现其中含cry1、cry2、cry4、cry8、cry9、cry20、cry22、cry28、cry30、cry31、cry37、cry40、cry46、cry52和cyt2共计15种基因...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 苏云金芽胞杆菌
    1.2 苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白
    1.3 Bt菌晶体蛋白结构与功能作用
    1.4 苏云金芽胞杆菌其它活性因子
        1.4.1 营养期杀虫蛋白
        1.4.2 外毒素
        1.4.3 肠毒素
        1.4.4 几丁质酶
        1.4.5 双效菌素
        1.4.6 Bt其它的毒力因子
    1.5 苏云芽胞杆菌的开发应用
    1.6 本研究的目的与意义
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 土样采集
        2.1.2 菌株和质粒
        2.1.3 培养基与抗生素
        2.1.4 主要实验试剂
        2.1.5 主要仪器
        2.1.6 供试昆虫
    2.2 实验方法
        2.2.1 苏云金芽胞杆菌的分离与晶体类型观察
        2.2.2 Bt菌SEM观察
        2.2.3 苏云金芽胞杆菌基因组的提取
        2.2.4 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的提取
        2.2.5 菌株晶体蛋白浓度测定与SDS-PAGE检测
        2.2.6 HD73-感受态细胞的制备
        2.2.7 质粒转化
        2.2.8 阳性转化子的筛选与鉴定
        2.2.9 质粒去甲基化
        2.2.10 PCR扩增操作
        2.2.11 酶切和连接体系
        2.2.12 PCR扩增产物的回收和连接
        2.2.13 质粒提取及穿梭表达载体的构建
        2.2.14 苏云金芽胞杆菌基因的鉴定
        2.2.15 PCR-RFLP分析
        2.2.16 菌株室内生物活性分析
        2.2.17 基因组测序以及组装
第三章 结果与分析
    3.1 菌株分离结果
        3.1.1 菌株的分离
        3.1.2 伴胞晶体形态的多样性
        3.1.3 基因型鉴定
        3.1.4 Bt菌株蛋白检测分析
        3.1.5 Bt菌株对棉铃虫的生物活性研究
        3.1.6 苏云金芽胞杆菌CS72-2和CS137-2的菌株特征
        3.1.7 菌株CS72-2和CS137-2蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析
        3.1.8 Bt菌株CS72-2和CS137-2生物活性测定
    3.2 2株Bt菌株杀虫基因的挖掘
    3.3 菌株CS72-2和CS137-2中基因的克隆、表达研究
        3.3.1 新基因的全长扩增与克隆
        3.3.2 基因序列分析
        3.3.4 cry28-like基因的克隆与蛋白表达
        3.3.5 cry37-like和cyt2-like克隆与蛋白表达
第四章 结论与讨论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3748295