柑橘U-box基因家族的鉴定和CRISPR/Cas9编辑CcPUB4基因的研究

发布时间：2023-02-23 18:12

　　盐胁迫是世界范围内危害植物的主要逆境胁迫之一,严重抑制植物的生长和产量。柑橘是世界上以及我国南方重要的果树种类之一,属于对盐极敏感的甜土植物,在中国柑橘主产区经常出现盐害现象,在盐胁迫下植株表现出失绿、叶尖焦枯、枯枝落叶、品质变劣,甚至死树等症状(魏清江等,2015;Maas.,1993)。随着工业污染加重和化肥使用不当等人为因素的出现,盐碱土面积在不断增加,给柑橘生产带来了重大的威胁。所以挖掘出与盐胁迫相关基因,了解柑橘对盐胁迫的响应及适应性机制,培育出抗逆性品种对生产具有重要意义。U-box蛋白广泛存在于植物基因组中,其结构高度保守,在泛素降解途径中发挥E3泛素连接酶的作用(Smalle et al.,2004),在非生物胁迫响应过程中具有重要作用(Vierstra.,2009)。已有研究表明植物U-box蛋白(Plant U-box protein,PUB)通过调控盐胁迫响应基因的表达,提高植物体排Na⁺和保K⁺能力,维持体内的Na⁺/K⁺平衡,最终提高植物的耐盐性(李巧茹,2017)。因此,...

【文章页数】：85 页

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摘要
ABSTRACT
第1章 文献综述
    1.1 土地盐渍化
    1.2 盐胁迫对植物的伤害
        1.2.1 水分亏缺
        1.2.2 离子毒害
        1.2.3 营养失衡
    1.3 盐胁迫对植物生理的影响
        1.3.1 盐胁迫对植物生长的影响
        1.3.2 盐胁迫对植物光合作用的影响
        1.3.3 盐胁迫对活性氧和抗氧化酶的影响
    1.4 柑橘对盐胁迫的适应机制
        1.4.1 形态学的适应
        1.4.2 渗透调节物质合成
        1.4.3 ROS清除
    1.5 泛素/26S蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome pathway,UPP)
    1.6 U-box蛋白
        1.6.1 U-box蛋白的结构特点
        1.6.2 U-box蛋白的分类
        1.6.3 U-box蛋白的功能
    1.7 CRISPR/Cas9 系统
        1.7.1 CRISPR/Cas9 系统的发展
        1.7.2 CRISPR/Cas系统的结构及分类
        1.7.3 CRISPR/Cas9 系统的应用
第2章 前言
    2.1 立题依据
    2.2 创新性
    2.3 技术路线
第3章 柑橘U-box基因家族的鉴定及表达分析
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 柑橘U-box基因家族成员鉴定
        3.2.2 柑橘U-box家族系统进化及蛋白结构域分析
        3.2.3 柑橘U-box家族基因结构及Scaffold定位分析
        3.2.4 柑橘U-box基因家族的启动子分析
        3.2.5 胁迫处理
        3.2.6 总RNA提取
        3.2.7 cDNA合成
        3.2.8 实时荧光定量PCR与数据分析
        3.2.9 柑橘U-box家族基因的冷胁迫表达模式分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 柑橘U-box基因家族成员信息
        3.3.2 柑橘U-box家族系统进化及蛋白结构域分析
        3.3.3 柑橘U-box家族基因结构及染色体定位分析
        3.3.4 柑橘U-box基因家族的启动子分析
        3.3.5 U-box家族基因的表达分析
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 柑橘盐胁迫基因CcPUB4的CRISPR/Cas9 载体构建
    4.1 实验材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 载体及菌株
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 主要试剂
        4.1.5 主要溶液的配制
        4.1.6 CcPUB4 基因的生物信息学分析
        4.1.7 枳壳和朱红桔差异分析
        4.1.8 CcPUB4 基因g RNA靶位点设计
    4.2 CcPUB4 基因CRISPR/Cas9 载体构建
        4.2.1 BbsⅠ单酶切pP1C.
        4.2.2 pP1C.5 载体酶切产物回收
        4.2.3 引物退火形成双链
        4.2.4 双链g RNA连接到pP1C.5 载体
        4.2.5 连接产物转化至大肠杆菌
        4.2.6 单克隆菌液PCR检测
        4.2.7 pP1C.5 重组质粒提取
        4.2.8 pP1C.5 重组载体与pP1C.1C载体的双酶切
        4.2.9 纯化回收酶切后的片段
        4.2.10 目的片段与pP1C.1C载体连接与转化
        4.2.11 单克隆菌液PCR检测
        4.2.12 gRNA-1和g RNA-6 同时连接到pP1C.1C
        4.2.13 pP1C.1C重组载体转化农杆菌EHA105 感受态细胞
        4.2.14 柑橘的遗传转化
        4.2.15 转基因植株的鉴定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 CcPUB4 基因的生物信息学分析
        4.3.2 枳壳和朱红桔差异分析
            4.3.2.1 NaCl诱导枳壳朱红桔中CcPUB4 基因表达分析
            4.3.2.2 枳壳和朱红桔 CcPUB4 基因的 CDS 序列差异
        4.3.3 CcPUB4 基因的gRNA设计
        4.3.4 CRISPR/Cas9 载体的构建
        4.3.5 T0代CcPUB4 基因敲植株表型和突变鉴定
    4.4 讨论
    4.5 结论
参考文献
附录
致谢
发表论文及参加课题



本文编号：3748489