果蝇how基因生物学功能的初步研究

发布时间：2023-02-23 19:52

　　大量研究表明RNA结合蛋白在生殖细胞发生过程中扮演者重要角色,它通过调控RNA的各种活动,在转录和转录后水平影响基因表达。果蝇how基因编码产物为RNA结合蛋白,现在有许多研究结果表明该蛋白参与果蝇体内多种活动进程,如肌肉细胞的迁移、类固醇代谢、心率控制、性别决定以及中胚层分裂等等。本文主要研究held out wings(how)基因在生殖细胞中的功能,以及LC结构域对HOW蛋白聚集的影响。首先,我们通过原核纯化HOW蛋白免疫小鼠,获得了 HOW蛋白鼠源抗体并通过Western Blot和免疫荧光染色分析了 HOW蛋白的表达情况。然后我们制备了 how基因敲低的转基因果蝇,发现在其生殖细胞中特异性敲低how基因后,果蝇生殖干细胞丢失,并且随着果蝇发育最终引起生殖细胞的全部丢失。接下来,我们研究了 LC结构域对HOW蛋白的影响,我们发现LC结构域不影响HOW蛋白在细胞中的定位。进一步的通过半变性凝胶电泳试验,我们发现HOW蛋白的LC结构域(QA-Rich)在很大程度上影响了该蛋白在体外的聚集,但是这种聚集与蛋白质之间二硫键的形成没有太大关系。在体外进行的蛋白质相变试验表明LC结构域缺失...

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

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致谢
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 果蝇生殖干细胞
        1.1.1 果蝇雌性生殖干细胞
        1.1.2 果蝇雄性生殖干细胞
    1.2 基因编辑技术概况
        1.2.1 ZFNs介导的基因编辑
        1.2.2 TALENs介导的基因编辑
        1.2.3 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑
    1.3 RNA结合蛋白的研究进展
    1.4 本研究的目的及意义
2 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 果蝇品系
        2.1.2 实验所用质粒载体
        2.1.3 实验所用菌株
        2.1.4 实验所用细胞
        2.1.5 实验所用主要试剂
        2.1.6 实验所用主要引物
        2.1.7 溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 Cas9/sgRNA方法制备突变体果蝇
        2.2.2 转基因果蝇品系构建
        2.2.3 用QIAGEN Plasmid Mini Kit中提质粒
        2.2.4 Inoue法制备DH5α感受态细胞
        2.2.5 构建载体
        2.2.6 质粒小量提取
        2.2.7 原核蛋白表达及其纯化
        2.2.8 质粒大量提取
        2.2.9 细胞的培养与转染
        2.2.10 半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳法(SDD-AGE)
        2.2.11 蛋白质相变(Protein Phase Separation)
        2.2.12 Trizol法提取蛋白质
        2.2.13 蛋白免疫印迹实验(Western Blot)
        2.2.14 果蝇基因组DNA提取
        2.2.15 果蝇卵巢和睾丸的免疫组织化学染色
3 实验结果
    3.1 果蝇HOW抗体的制备及HOW蛋白的表达分析
    3.2 how基因沉默后造成生殖细胞丢失
    3.3 LC结构域的存在不影响HOW蛋白在细胞中的定位
    3.4 LC结构域影响HOW在细胞内聚集
    3.5 LC结构域影响HOW蛋白在体外相变
    3.6 利用CRISPR/Cas9系统构建how突变体
4 讨论
    4.1 how基因对果蝇的生长发育是不可缺失的
    4.2 how基因对果蝇生殖器官的发育是不可缺失的
    4.3 LC结构域不影响HOW蛋白在细胞内定位
    4.4 HOW蛋白在体外有聚集现象
    4.5 LC结构域对于其聚集发挥着一定作用
5 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
作者简介



本文编号：3748645