弓形虫MORN1/2基因缺失株的构建及其免疫保护性研究

发布时间：2023-03-03 22:38

　　刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,可以感染几乎所有的温血动物,引起严重的弓形虫病症,造成新生儿流产、死胎等。弱毒活疫苗对控制弓形虫的传播有潜在价值,但报道甚少。MORN基因家族因参与速殖子细胞骨架的形成过程而发挥重要作用,是作为研制抗弓形虫弱毒活疫苗的理想候选基因。本研究的目的在于构建弓形虫MORN1与MORN2基因缺失株,阐明MORN基因家族成员的在弓形虫中的生物学功能,评价它们作为弱毒活疫苗的免疫保护力,探究其作为弱毒活疫苗的潜在价值。首先,为研究MORN2基因的生物学功能是否与弓形虫的毒力相关,我们利用CRISPR/Cas9技术,对弓形虫I型RH虫株的MORN2基因进行了敲除。利用同源重组,在基因缺失处插入乙胺嘧啶药物抗性的片段DHFR。通过单克隆筛选以及PCR鉴定,成功获得MORN2基因缺失株。对该缺失株进行体外噬斑试验和体内毒力试验后,发现MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和对小鼠感染的毒力。因此我们认为MORN2基因的缺失不影响弓形虫RH虫株的毒力,其缺失株不具备成为弱毒疫苗的可能性。然后,为了研究ΔMORN...

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 弓形虫及弓形虫病简述
        1.1.1 病原体
        1.1.2 生活史及传播
        1.1.3 弓形虫病及流行
    1.2 CRISPR-Cas9介导的弓形虫基因编辑技术
        1.2.1 CRISPR/Cas9系统简介
        1.2.2 应用于弓形虫的基因筛选标记
        1.2.3 CRISPR/Cas9技术在弓形虫中的应用
    1.3 弓形虫疫苗的研究进展
        1.3.1 传统疫苗研究
        1.3.2 基于毒力基因敲除的弱毒疫苗
    1.4 弓形虫MORN基因的研究进展
    1.5 本研究的目的与意义
第二章 弓形虫MORN2基因缺失株的构建及表型研究
    2.1 材料方法
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 虫株与细胞
        2.1.3 试剂与仪器
        2.1.4 主要溶液的配置
        2.1.5 MORN2基因的CRISPR/Cas9质粒构建
        2.1.6 MORN2基因同源臂的构建
        2.1.7 电转染弓形虫速殖子
        2.1.8 阳性单克隆的筛选
        2.1.9 噬斑试验
        2.1.10 小鼠体内毒力试验
    2.2 结果
        2.2.1 MORN2靶向的CRISPR/Cas9质粒
        2.2.2 DHFR抗性的MORN2同源片段
        2.2.3 阳性单克隆株的筛选
        2.2.4 噬斑试验
        2.2.5 小鼠毒力试验
    2.3 讨论
第三章 弓形虫MORN1基因缺失株的构建及免疫保护力评价
    3.1 材料方法
        3.1.1 实验动物
        3.1.2 虫株与细胞
        3.1.3 主要溶液的配制
        3.1.4 MORN1基因的CRISPR/Cas9质粒构建
        3.1.5 MORN1同源臂的构建
        3.1.6 电转染弓形虫速殖子
        3.1.7 阳性克隆的筛选
        3.1.8 单克隆株的免疫荧光鉴定
        3.1.9 免疫效果评价
        3.1.10 统计学分析
    3.2 结果
        3.2.1 MORN1靶向的CRISPR/Cas9质粒
        3.2.2 DHFR抗性的MORN1同源片段
        3.2.3 阳性克隆的筛选
        3.2.4 单克隆株的免疫荧光鉴定
        3.2.5 ΔMORN1缺失株毒力检测
        3.2.6 免疫鼠Ig G、Ig G1及Ig G2a抗体水平
        3.2.7 免疫鼠淋巴细胞增殖能力
        3.2.8 免疫鼠细胞因子水平
        3.2.9 RH、PYS、Tg C7株的急性感染
        3.2.10 Ⅱ型PRU株的慢性感染
        3.2.11 先天性感染试验
    3.3 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3753241