表达RGD和MEL基因重组减毒沙门氏菌的构建及其对黑色素瘤的靶向治疗作用

发布时间：2023-03-05 01:35

　　黑色素瘤(melanoma)是死亡率极高的皮肤恶性肿瘤,在兽医临床上常见于老龄动物,在全球范围内发病率呈逐年上升趋势。其特点是恶性程度高、进展快、易远处转移,是一种对常规治疗药物具有较强的抗性,在临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤,对食品卫生和公共安全构成极大的危害。随着分子生物学、免疫学及相关学科的发展,基因治疗逐渐显示出巨大的优势,现已成为肿瘤治疗研究的热点。黑色素瘤作为一种浅表性肿瘤,非常适用于基因治疗的观察和研究。实体瘤中因存在局部免疫抑制、缺氧、血液供应不足、坏死区等,使肿瘤微环境中形成免疫逃逸现象,导致化疗药物无法顺利到达并发挥治疗作用,但却为一系列厌氧菌及兼性厌氧菌提供了有利的生长环境。这一发现预示某些细菌可能成为新型的肿瘤基因治疗载体。目前,影响肿瘤基因治疗效果的两大关键因素是治疗载体系统和治疗基因的选择。因此,寻找合适的靶向性载体和治疗基因是肿瘤基因治疗的核心,同时也是本课题的研究目的及科学意义所在。肿瘤靶向肽(RGD)是细胞外基质与细胞整合素αvβ3之间结合的强效竞争性拮抗剂,常被用作肿瘤靶向标记物。蜂毒肽(MEL)是蜂毒中具有药理作用和生物学活性的主要组分,在抑制肿...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 减毒沙门氏菌在肿瘤基因治疗中的研究进展
        1.1.1 细菌治疗肿瘤的研究背景
        1.1.2 沙门氏菌载体在肿瘤治疗中的研究现状和问题
            1.1.2.1 沙门氏菌载体在肿瘤治疗中的研究现状
            1.1.2.2 沙门氏菌载体在肿瘤治疗中的问题
    1.2 肿瘤靶向肽在肿瘤治疗中的作用机制和研究进展
        1.2.1 RGD靶向肿瘤的作用机制
        1.2.2 RGD治疗肿瘤的研究进展
    1.3 蜂毒肽的抑瘤机制及研究进展
        1.3.1 蜂毒肽作为药物的研究背景
        1.3.2 蜂毒肽的抑瘤活性及存在问题
    1.4 研究方案
        1.4.1 技术路线
        1.4.2 研究内容和意义
第二章 表达RGD及MEL双基因减毒沙门氏菌的制备
    第一节 表达RGD及MEL双基因真核表达质粒的构建
        2.1 材料与方法
            2.1.1 材料
                2.1.1.1 菌株、细胞系和载体
                2.1.1.2 试剂
                2.1.1.3 主要仪器
                2.1.1.4 溶液和培养基
            2.1.2 方法
                2.1.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
                2.1.2.2 引物设计
                2.1.2.3 重组质粒p MD-RGD-MEL和pMD-MEL的提取
                2.1.2.4 pEGFP-N1和p MD-RGD-MEL、pMD-MEL的双酶切
                2.1.2.5 产物回收
                2.1.2.6 质粒的制备与鉴定
                2.1.2.7 重组质粒图谱
        2.2 结果与分析
            2.2.1 RGD-MEL及MEL基因扩增
            2.2.2 pEGFP-RGD-MEL重组表达质粒的鉴定
            2.2.3 pEGFP-MEL重组表达质粒的鉴定
        2.3 讨论
        2.4 小结
    第二节 重组减毒沙门氏菌LH430/pEGFP-RGD-MEL的制备及稳定性检测
        2.5 材料与方法
            2.5.1 材料
                2.5.1.1 菌株、细胞系和载体
                2.5.1.2 主要试剂
                2.5.1.3 主要仪器
            2.5.2 方法
                2.5.2.1 重组减毒沙门氏菌LH430感受态细胞的制备
                2.5.2.2 重组减毒沙门氏菌的构建与鉴定
                2.5.2.3 重组减毒沙门氏菌遗传稳定性鉴定
                2.5.2.4 全自动生长曲线分析仪记录LH430/pEGFP-RGD-MEL生长曲线
                2.5.2.5 B16细胞的培养
                2.5.2.6 重组减毒沙门氏菌侵染B16细胞
                2.5.2.7 重组减毒沙门氏菌侵染B16细胞总RNA的提取
                2.5.2.8 RT-PCR检测目的基因RGD-MEL和MEL的表达
                2.5.2.9 Western blotting检测
        2.6 结果与分析
            2.6.1 重组减毒沙门氏菌的制备与鉴定
            2.6.2 重组减毒沙门氏菌的稳定性
            2.6.3 重组减毒沙门氏菌生长曲线的测定
            2.6.4 重组减毒沙门氏菌侵染B16细胞检测结果
            2.6.5 RT-PCR检测目的基因表达
            2.6.6 Western Blotting检测蛋白表达结果
        2.7 讨论
        2.8 小结
第三章 LH430/pEGFP-RGD-MEL的体外抑瘤作用的研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
            3.1.1.1 菌株、细胞系和载体
            3.1.1.2 主要试剂
            3.1.1.3 主要仪器
        3.1.2 方法
            3.1.2.1 细胞培养
            3.1.2.2 LH430/pEGFP-RGD-MEL侵染细胞
            3.1.2.3 CCK-8 法检测LH430/pEGFP-RGD-MEL对细胞增殖作用的影响
            3.1.2.4 Western blotting检测B16细胞中凋亡蛋白
            3.1.2.5 扫描电镜观察
            3.1.2.6 流式细胞术检测B16细胞凋亡情况
            3.1.2.7 细胞划痕试验检测B16细胞迁移能力
            3.1.2.8 细胞趋化试验检测FBS介导B16细胞的迁移能力
            3.1.2.9 细胞侵袭试验检测B16细胞的侵袭能力
    3.2 结果与分析
        3.2.1 LH430/pEGFP-RGD-MEL抑制肿瘤细胞及正常细胞增殖作用的测定
        3.2.2 LH430/pEGFP-RGD-MEL对肿瘤细胞及正常细胞的IC50值
        3.2.3 LH430/pEGFP-RGD-MEL侵染B16细胞中凋亡蛋白的表达
        3.2.4 扫描电镜观察LH430/pEGFP-RGD-MEL侵染B16细胞表面形态变化
        3.2.5 LH430/pEGFP-RGD-MEL对B16细胞的凋亡作用
        3.2.6 LH430/pEGFP-RGD-MEL抑制B16细胞迁移情况
        3.2.7 LH430/pEGFP-RGD-MEL可抑制FBS介导的B16细胞迁移
        3.2.8 LH430/pEGFP-RGD-MEL可抑制B16细胞的侵袭能力
    3.3 讨论
    3.4 小结
第四章 小鼠黑色素瘤模型的构建
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
            4.1.1.1 细胞系和试验动物
            4.1.1.2 主要试剂
            4.1.1.3 主要仪器
        4.1.2 方法
            4.1.2.1 B16实体瘤模型的建立与荷瘤小鼠的治疗
            4.1.2.2 荷瘤小鼠活体成像
            4.1.2.3 Q-PCR检测RGD-MEL基因在各组织中的表达
    4.2 结果与分析
        4.2.1 荷瘤小鼠生存曲线及体重变化曲线
        4.2.2 LH430/pEGFP-RGD-MEL对荷瘤小鼠内脏器官及肿瘤重量的影响
        4.2.3 小鼠活体成像结果
        4.2.4 Q-PCR检测各组织MEL基因表达量
    4.3 讨论
    4.4 小结
第五章 小鼠黑色素瘤模型的病理学检测
    5.1 材料与方法
        5.1.1 材料
            5.1.1.1 试验组织
            5.1.1.2 主要试剂
            5.1.1.3 主要仪器
            5.1.1.4 试验试剂
        5.1.2 方法
            5.1.2.1 冰冻切片的制备
            5.1.2.2 病理切片的制备及HE染色
            5.1.2.3 免疫组织化学染色
            5.1.2.4 TUNEL法染色
            5.1.2.5 肿瘤组织细菌计数
    5.2 结果与分析
        5.2.1 肿瘤组织冰冻切片结果
        5.2.2 各组织HE染色结果
        5.2.3 各肿瘤组织免疫组织化学染色结果
        5.2.4 TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡状况
        5.2.5 肿瘤组织中细菌残留状况
    5.3 讨论
    5.4 小结
第六章 RNA-seq研究LH430/pEGFP-RGD-MEL抑瘤机理
    6.1 材料与方法
        6.1.1 材料
            6.1.1.1 试验组织
            6.1.1.2 主要试剂
            6.1.1.3 主要仪器
        6.1.2 方法
            6.1.2.1 肿瘤组织中RNA提取
            6.1.2.2 RNA质量检测
            6.1.2.3 RNA文库构建
    6.2 结果与分析
        6.2.1 测序组装结果统计
        6.2.2 差异基因富集功能分析
        6.2.3 差异基因的KEGG代谢通路结果分析
        6.2.4 深入分析结果
    6.3 讨论
    6.4 小结
结论
论文创新点
参考文献
附录一 序列信息
附录二 测序报告
攻读硕士学位期间发表的论文
致谢



本文编号：3755424