鸭源鸡杆菌中国分离株F17样菌毛基因的鉴定及其敲除株的构建
发布时间：2023-03-07 20:30
鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)是巴氏杆菌科鸡杆菌属的革兰氏阴性菌,主要感染鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类。目前越来越多的研究证明,G.anatis作为一种条件性致病菌,不仅是构成鸡上呼吸道和下生殖道正常菌群的一部分,也可引起蛋鸡输卵管炎、腹膜炎等疾病,导致产蛋量下降、死亡率增加等。目前已经确定了G.anatis的数种毒力因子,但其致病机制仍未被阐明。黏附是微生物定殖并侵袭黏膜组织的关键过程。G.anatis作为一种黏膜微生物,已经被证实具有黏附塑料制品、形成生物被膜及产生一种糖蛋白样血凝素等黏附相关功能,但在G.anatis定殖感染自然宿主的过程中发挥关键作用的具体因素还不清楚。在巴氏杆菌科的其他成员中,已经报道了包括菌毛在内的多种黏附素的存在,其中菌毛作为一种毛发样、细长的菌体表面附属结构,是多种细菌的重要毒力因子。鉴于以上背景,本研究对鸭源鸡杆菌中国分离株中F17样菌毛主要类型Flf的分布与表达情况进行了探究,并分析菌毛主要亚单位蛋白FlfA的免疫原性和反应原性。同时,通过鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞的黏附和侵袭特性研究,筛选出致病力相对强的...
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
英文缩略表
摘要
文献综述
1 鸭源鸡杆菌概述
1.1 鸭源鸡杆菌的病原学特征
1.1.1 主要形态特征
1.1.2 主要培养特性
1.1.3 主要生化特性
1.2 鸭源鸡杆菌的致病性
1.3 鸭源鸡杆菌的传播途径
1.4 鸭源鸡杆菌的毒力因子
1.4.1 RTX样毒素GtxA
1.4.2 菌毛
1.4.3 外膜囊泡
1.4.4 荚膜
1.4.5 金属蛋白酶
1.4.6 生物被膜
1.4.7 血凝素
2 巴氏杆菌科基因敲除技术的研究进展
2.1 自然转化法
2.2 接合转移法
2.3 Red重组技术
3 小结
试验一 鸭源鸡杆菌flfA基因的鉴定分析及原核表达
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成
1.2.2 菌株的复苏和细菌基因组的粗提
1.2.3 G. anatis flfA基因的克隆及其序列分析
1.2.4 Flf A蛋白B细胞抗原表位的预测
1.2.5 原核表达载体pET-28a-flfA的构建
1.2.6 菌毛蛋白FlfA的表达和纯化
1.2.7 兔源抗血清的制备及重组蛋白的免疫印迹(Western Blotting)分析
1.2.8 不同鸭源鸡杆菌中FlfA蛋白表达情况的检测
2 结果
2.1 18株G. anatis flfA基因的克隆及其序列分析结果
2.2 6株G. anatis flfA基因推导的氨基酸序列同源性分析及其优势抗原表位的预测
2.3 原核表达载体pET-28a-flfA的构建
2.4 SDS-PAGE检测重组蛋白FlfA的表达
2.5 重组蛋白及不同鸭源鸡杆菌中FlfA蛋白表达情况的免疫印迹鉴定
3 讨论
试验二 鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞黏附和侵袭能力的测定
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
1.1.2 主要试剂
1.1.3 实验动物
1.2 方法
1.2.1 菌株复壮
1.2.2 鸡输卵管原代上皮细胞的制备和培养
1.2.3 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru1SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞侵袭的免疫组织化学检测
1.2.4 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru1SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞黏附的免疫组织化学检测
1.2.5 19株鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞黏附能力的测定
2 结果
2.1 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru1SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞的侵袭情况
2.2 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru1SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞的黏附动态
2.3 19株鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞的黏附能力的测定结果
3 讨论
试验三 鸭源鸡杆菌flf A基因缺失突变株的筛选
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
1.1.2 本研究中使用的质粒和部分载体的结构示意图
1.1.3 主要试剂
1.1.4 溶液配制
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成
1.2.2 Gmr抗性盒子及同源重组质粒pBC-flfA-Gmr的构建
1.2.3 同源重组质粒pREΔflfA的构建
1.2.4 G. anatis自然感受态细胞的制备和突变株的筛选
1.2.5 通过接合转移法进行突变株的筛选
2 结果
2.1 同源重组质粒pBC-flfA-Gmr的构建
2.2 同源重组质粒pREΔflfA的构建
2.3 自然转化法筛选突变株的结果
2.4 接合转移法筛选突变株的结果
3 讨论
全文总结
参考文献
附录
ABSTRACT
本文编号：3757839
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
英文缩略表
摘要
文献综述
1 鸭源鸡杆菌概述
1.1 鸭源鸡杆菌的病原学特征
1.1.1 主要形态特征
1.1.2 主要培养特性
1.1.3 主要生化特性
1.2 鸭源鸡杆菌的致病性
1.3 鸭源鸡杆菌的传播途径
1.4 鸭源鸡杆菌的毒力因子
1.4.1 RTX样毒素GtxA
1.4.2 菌毛
1.4.3 外膜囊泡
1.4.4 荚膜
1.4.5 金属蛋白酶
1.4.6 生物被膜
1.4.7 血凝素
2 巴氏杆菌科基因敲除技术的研究进展
2.1 自然转化法
2.2 接合转移法
2.3 Red重组技术
3 小结
试验一 鸭源鸡杆菌flfA基因的鉴定分析及原核表达
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成
1.2.2 菌株的复苏和细菌基因组的粗提
1.2.3 G. anatis flfA基因的克隆及其序列分析
1.2.4 Flf A蛋白B细胞抗原表位的预测
1.2.5 原核表达载体pET-28a-flfA的构建
1.2.6 菌毛蛋白FlfA的表达和纯化
1.2.7 兔源抗血清的制备及重组蛋白的免疫印迹(Western Blotting)分析
1.2.8 不同鸭源鸡杆菌中FlfA蛋白表达情况的检测
2 结果
2.1 18株G. anatis flfA基因的克隆及其序列分析结果
2.2 6株G. anatis flfA基因推导的氨基酸序列同源性分析及其优势抗原表位的预测
2.3 原核表达载体pET-28a-flfA的构建
2.4 SDS-PAGE检测重组蛋白FlfA的表达
2.5 重组蛋白及不同鸭源鸡杆菌中FlfA蛋白表达情况的免疫印迹鉴定
3 讨论
试验二 鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞黏附和侵袭能力的测定
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
1.1.2 主要试剂
1.1.3 实验动物
1.2 方法
1.2.1 菌株复壮
1.2.2 鸡输卵管原代上皮细胞的制备和培养
1.2.3 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru1SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞侵袭的免疫组织化学检测
1.2.4 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru1SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞黏附的免疫组织化学检测
1.2.5 19株鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞黏附能力的测定
2 结果
2.1 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru1SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞的侵袭情况
2.2 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru1SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞的黏附动态
2.3 19株鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞的黏附能力的测定结果
3 讨论
试验三 鸭源鸡杆菌flf A基因缺失突变株的筛选
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
1.1.2 本研究中使用的质粒和部分载体的结构示意图
1.1.3 主要试剂
1.1.4 溶液配制
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成
1.2.2 Gmr抗性盒子及同源重组质粒pBC-flfA-Gmr的构建
1.2.3 同源重组质粒pREΔflfA的构建
1.2.4 G. anatis自然感受态细胞的制备和突变株的筛选
1.2.5 通过接合转移法进行突变株的筛选
2 结果
2.1 同源重组质粒pBC-flfA-Gmr的构建
2.2 同源重组质粒pREΔflfA的构建
2.3 自然转化法筛选突变株的结果
2.4 接合转移法筛选突变株的结果
3 讨论
全文总结
参考文献
附录
ABSTRACT
本文编号：3757839
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3757839.html
最近更新
教材专著
