水稻垩白基因OsPK2的图位克隆与功能研究

发布时间：2023-03-12 14:10

　　淀粉是水稻种子中含量最多(60%-90%)的储能物质。其含量及形态的变化对水稻产量及品质有重大影响。淀粉的生物合成精密而复杂,有关淀粉合成的整体网络机制及具体细节还未能清晰阐明,所以,挖掘与验证新的影响淀粉合成的因子具有重要研究意义。我们从EMS诱变中花11的突变体库中筛选到一个表型明显且稳定遗传的垩白突变体ospk2,并进行了深入研究,主要结果如下:1.本研究中的突变体ospk2表现出心白表型,胚乳中间部位的淀粉颗粒之间排列松散;其灌浆速率明显降低;成熟种子的总淀粉和直链淀粉含量显著下降,蛋白和脂肪的含量明显增多,支链淀粉的中短链(DP6-12)比例降低,中长链(DP13-25)有所增多,脂肪酸含量增加;胶稠度和米粉粘度明显降低;ospk2突变体米粉在4M尿素溶液中的溶解膨胀度差异最大。结果充分表明OsPK2基因对稻米胚乳中的淀粉有重要影响。2.胚乳发育前期透射电镜结果表明,ospk2突变体胚乳中复合淀粉颗粒的形成及造粉体发育存在异常。突变体内既存在少量能正常膨大的淀粉颗粒,发育正常的造粉体;还存在大量的、小的、散乱的淀粉粒,多数淀粉单粒间间隙明显,排列松散,无法形成复合颗粒。结果表...

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 淀粉的生物合成
        1.1.1 淀粉的结构
        1.1.2 淀粉的生物合成
    1.2 有关淀粉生物合成的调控
        1.2.1 淀粉合成的相关酶类的协同作用
        1.2.2 相关基因表达的调控
        1.2.3 其他基因的影响
    1.3 丙酮酸激酶(PK)的研究近况
        1.3.1 丙酮酸激酶在糖酵解途径中的作用
        1.3.2 PKs的同工酶
        1.3.3 PKs亚基组成
        1.3.4 PKs的理化特性
        1.3.5 PKs的相关调控
        1.3.6 PKs家族
        1.3.7 植物PKs的相关研究
    1.4 本研究的目的与意义
第二章 水稻垩白突变体ospk2的表型鉴定
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 稻米产量性状的测定
        2.1.3 测定水稻灌浆的动态过程中干物质积累量
        2.1.4 扫描电镜观察成熟糙米的自然横断面
        2.1.5 发芽试验
        2.1.6 胚乳半薄切片的制备及淀粉颗粒的染色观察
        2.1.7 扫描电镜观察提取的胚乳淀粉颗粒
        2.1.8 动态胚乳的透射电镜观察
        2.1.9 总淀粉含量的测定
        2.1.10 直链淀粉含量的测定
        2.1.11 总蛋白含量的测定
        2.1.12 总脂肪含量的测定
        2.1.13 胶稠度测定
        2.1.14 RVA谱分析
        2.1.15 测定米粉的支链淀粉结构(链长分布)
        2.1.16 米粉尿素膨胀特性的检测
    2.2 结果与分析
        2.2.1 ospk2突变体的表型鉴定
        2.2.2 观察比较野生型ZH11与ospk2突变体的胚乳中复合淀粉颗粒
        2.2.3 测定野生型ZH11与ospk2突变体的淀粉相关理化性质
    2.3 小结
        2.3.1 ospk2突变体胚乳出现明显缺陷
        2.3.2 ospk2突变体的胚乳发育过程中复合淀粉颗粒的形成存在异常
        2.3.3 收获一年的ospk2突变体种子的发芽率极显著降低
        2.3.4 ospk2突变体胚乳中淀粉特性发生明显变化
第三章 OsPK2基因的图位克隆与功能互补
    3.1 材料与方法
        3.1.1 种植定位群体与挑选极端单株
        3.1.2 叶片总DNA的提取方法(SDS法及DNA快提法)
        3.1.3 PCR扩增
        3.1.4 8%PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测PCR产物
        3.1.5 开发与筛选具有的多态性分子标记及基因定位
        3.1.6 预测候选基因与测序
        3.1.7 构建多种转基因的表达载体及转化农杆菌
        3.1.8 转基因阳性植株的鉴定
        3.1.9 转基因材料表型考察
    3.2 结果与分析
        3.2.1 ospk2突变体的遗传分析
        3.2.2 OsPK2基因的图位克隆和候选基因分析
        3.2.3 转基因材料分析
    3.3 小结
        3.3.1 OsPK2是影响稻米淀粉合成的新基因
        3.3.2 OsPK2影响水稻胚乳中的复合淀粉颗粒的形态及存在
第四章 OsPK2的功能分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 进化树构建与氨基酸序列比对分析
        4.1.3 提取RNA与消化
        4.1.4 DNA第一链的合成
        4.1.5 Real-timePCR
        4.1.6 GUS活性染色
        4.1.7 快速提取胚乳蛋白及Westernblot检测
        4.1.8 构建亚细胞定位载体及大提质粒
        4.1.9 转化水稻原生质体
        4.1.10 瞬时转化烟草表皮细胞
        4.1.11 真核蛋白表达与纯化
        4.1.12 组织蛋白的提取
        4.1.13 PK活性的测定
        4.1.14 丙酮酸含量测定
        4.1.15 酵母双杂交
        4.1.16 双分子荧光互补
    4.2 结果与分析
        4.2.1 OsPK2是一个高度保守的基因
        4.2.2 OsPK2基因的组织表达模式分析
        4.2.3 OsPK2的亚细胞定位分析
        4.2.4 OsPK2具有PK活性
        4.2.5 OsPK2能够与其他三个假定的PKp蛋白互作,形成复合体
        4.2.6 OsPK2突变影响多种代谢相关基因的表达变化,导致代谢出现紊乱..
    4.3 小结
        4.3.1 OsPK2为组成型表达基因,定位在叶绿体中
        4.3.2 OsPK2编码具有生物活性的PK
        4.3.3 OsPK2与其他假定的PK蛋白形成异源复合体
        4.3.4 OsPK2基因突变引起多重代谢相关基因表达量的改变
第五章 全文结论与讨论
参考文献
附录
致谢
作者简历



本文编号：3761365