玉米转录因子基因ZmEREB87的克隆及功能分析

发布时间：2017-05-18 16:01

  本文关键词：玉米转录因子基因ZmEREB87的克隆及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：玉米(Zea mays L.)是在世界范围内分布最广泛的粮食作物之一,也是非常重要的经济作物、家畜饲料和工业原料。在我国,玉米的播种面积已然超过小麦与水稻,成为第一大粮食作物。然而,干旱、低温、高盐、水涝、病害等环境因子严重影响玉米的生长发育,是造成玉米减产的主要原因。随着科学家们对分子生物学及功能基因组学研究的深入,挖掘关键抗逆基因资源,并采用基因工程或分子标记技术培育抗逆作物新品种已成为作物育种工作的主要方向。根据强抗旱型玉米自交系F83的干旱转录组测序结果,选取受干旱诱导明显上调表达的AP2/EREBP转录因子家族成员Zm EREB87作为研究对象,采用RTPCR方法从F83中克隆了该基因的CDS区,通过生物信息方法分析了该基因的基本结构特征及分子进化关系,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q RT-PCR)方法研究了该基因的组织特异性及在不同非生物胁迫下的诱导表达模式,通过构建Zm EREB87基因的植物过表达载体,采用农杆菌介导法分别转化拟南芥及烟草,对过表达株系的抗旱功能进行了初步分析,取得如下结果:1.根据玉米转录因子基因Zm EREB87的m RNA序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法从F83中克隆了该基因的CDS区,生物信息学分析表明,该基因编码315个氨基酸残基,理论分子量为33.8 KDa,理论等电点为5.25;不稳定系数为63.03,属于不稳定蛋白;保守结构域分析表明该基因编码蛋白属于EREBP亚家族的转录因子成员;进化分析表明,Zm EREB87蛋白与高粱的Sb EREBP蛋白亲缘关系较近,与拟南芥At ERF07蛋白及葡萄Vv EREBP蛋白亲缘关系较远。2.采用q RT-PCR方法分析了Zm EREB87基因的组织特异性及其在6种非生物胁迫下的诱导表达模式,结果表明Zm EREB87基因在幼芽中表达量最高;玉米叶片中Zm EREB87基因在ABA(100μM)、干旱脱水、高盐(250 m M Na Cl)、20%PEG、高温(42℃)胁迫中上调表达,在低温(4℃)胁迫中下调表达。表明Zm EREB87基因可能是通过ABA依赖的信号转导途径参与玉米应答非生物胁迫的过程。3.以p CAMBIA3300为基础载体,采用分步酶切和连接的方法,构建了含有1个Kpn I位点的载体p CAMBIA3300-K,然后通过构建中间载体p CAMBIA3300-K-EREB87从而构建了含有Zm EREB87基因的目的片段的植物表达载体p CAMBI A3300-35S-EREB87-NOS。采用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404,通过农杆菌叶盘法和花序浸染法分别对烟草和拟南芥进行遗传转化,得到了转基因阳性植株。4.对T1代转基因烟草进行自然脱水干旱处理,观察表型变化特,采用15%聚乙二醇(PEG)溶液对T1代烟草进行模拟干旱处理,分析其生理特性。表型变化结果显示,干旱处理后野生烟草萎蔫程度比转基因烟草严重,初步说明转基因烟草比野生烟草具有更强的抗旱能力。生理特性分析结果显示,转基因株系的相对含水量(RWC)、脯氨酸(Pro)含量、可溶性糖含量及超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)三种抗氧化酶活性均高于野生株系,而相对电导率、丙二醛(MDA)含量、过氧化氢(H2O2)含量低于野生株系,进一步表明了转基因烟草具有更强的抗旱性。5.对T2代转基因拟南芥进行干旱复水处理,观察表型变化特征并进行生理特性分析。表型变化显示,干旱处理后转基因拟南芥与野生拟南芥同时萎蔫,而复水后只有转基因株系恢复正常,初步说明转基因拟南芥比野生拟南芥具有更强的抗旱能力。生理特性分析显示,转基因株系的RWC、Pro含量、可溶性糖含量及SOD、POD、CAT活性均高于野生株系,而相对电导率、MDA含量、H2O2含量低于野生株系,进一步表明了转基因拟南芥具有更强的抗旱性。
【关键词】：玉米 转录因子 基因克隆 载体构建 遗传转化
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S513
【目录】：

• 摘要2-4
• SUMMARY4-7
• 缩略词表7-11
• Ⅰ 文献综述11-28
• 1 转录因子概述12-18
• 1.1 转录因子的概念12
• 1.2 转录因子的结构与功能12-14
• 1.3 转录因子的分类14-15
• 1.4 转录因子的活性15-17
• 1.5 转录因子的调控17-18
• 2 植物AP2/EREBP类转录因子家族18-22
• 2.1 AP2/EREBP类转录因子的结构特征19
• 2.2 AP2/EREBP转录因子家族的起源和进化19-20
• 2.3 AP2/EREBP家族转录因子的分类20-21
• 2.4 AP2/EREBP转录因子的功能21-22
• 3 玉米AP2/EREBP类转录因子研究进展22-26
• 3.1 玉米转录因子家族22-23
• 3.2 玉米AP2/EREBP转录因子23-25
• 3.3 玉米AP2/EREBP转录因子家族的抗逆性研究25-26
• 4 本研究目的及意义26-27
• 5 技术路线27-28
• Ⅱ 材料与方法28-51
• 1 材料28-31
• 1.1 植物材料28
• 1.2 菌种和质粒28
• 1.3 化学试剂、酶制剂及试剂盒28-29
• 1.4 主要仪器设备29
• 1.5 实验所需培养基29-31
• 1.6 抗生素及生长素31
• 2 方法31-51
• 2.1 玉米Zm EREB87目的基因的克隆及生物信息学分析31-36
• 2.2 玉米中Zm EREB87基因的诱导表达分析36-38
• 2.3 植物表达载体的构建及转化38-43
• 2.4 Zm EREB87转录因子基因的遗传转化43-48
• 2.5 转基因植株的抗旱性鉴定48-50
• 2.6 数据处理50-51
• Ⅲ 结果与分析51-82
• 1 克隆及生物信息学分析51-61
• 1.1 玉米Zm EREB87目的基因的克隆51-54
• 1.2 玉米Zm EREB87基因的生物信息学分析54-61
• 2 不同非生物胁迫下玉米ZMEREB87基因的表达模式61-64
• 2.1 玉米Zm EREB87基因的组织特性表达61-62
• 2.2 不同非生物胁迫Zm EREB87基因表达的影响62-64
• 3 PCAMBIA3300-35S-EREB87-NOS植物表达载体构建及转化64-70
• 3.1 自连载体p CAMBIA3300-K的制备64-65
• 3.2 中间载体p CAMBIA3300-K-EREB87的构建65-66
• 3.3 表达载体p CAMBIA3300-35S-EREB87-NOS的构建66-69
• 3.4 植物表达载体转化及鉴定69-70
• 4 玉米ZMEREB87基因对烟草及拟南芥的转化70-73
• 4.1 玉米Zm EREB87基因转化烟草70-72
• 4.2 玉米Zm EREB87基因转化拟南芥72-73
• 5 转基因植株的抗旱鉴定73-82
• 5.1 转基因烟草的抗旱鉴定73-78
• 5.2 转基因拟南芥的抗旱鉴定78-82
• Ⅳ 讨论82-86
• 1 玉米ZMEREB87基因的克隆及生物信息学分析82-83
• 2 玉米ZMEREB87基因的诱导表达83
• 3 ZMEREB87基因的植物表达载体构建及转化83-84
• 4 转ZMEREB87基因植株的抗旱性研究84-86
• Ⅴ 结论86-88
• 参考文献88-92
• 致谢92-93
• 作者简介93-94
• 导师简介94-95

【参考文献】

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本文编号：376463