玉米铁还原酶基因ZmFRO2的克隆与功能分析

发布时间：2023-03-28 11:18

　　铁对植物正常生长和良好发育所起的作用具有微量而高效的特点。在作物育种工作中,增加作物及其籽粒铁含量对改善作物品质、提高作物产量具有重要意义。前人已对拟南芥、番茄、大豆、水稻、花生、蒺藜苜蓿等高等植物FRO(Ferric Reduction Oxidase)家族基因进行了研究。本研究以AtFRO2氨基酸序列为探针运行Blast搜寻并克隆ZmFRO2基因,对Zm/FRO2进行生物信息学分析、表达模式和亚细胞定位分析,通过构建ZmFRO2过表达载体,利用农杆菌介导的方法获得转基因玉米,为解析ZmFRO2的生理功能,对转基因玉米进行相关生理指标检测及表型分析,主要研究结果如下:1.为了解ZmFRO2基因及其蛋白的特征,对ZmFRO2基因及其蛋白进行了生物信息学分析。ZmFRO2基因位于2号染色体,全长4590bp,cDNA全长2585bp;ZmFRO2蛋白由759个氨基酸组成,经氨基酸序列比对和跨膜结构域预测发现,ZmFRO2蛋白具有10个跨膜区域,Ⅴ和Ⅶ跨膜区上有两对组氨酸残基构成的亚铁血红素结合区,Ⅷ跨膜区内存在氧化还原标志序列,这些特征在各FRO之间高度保守。表明ZmFRO2具有发挥铁还...

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 植物体内铁的吸收、转运
        1.1.1 植物吸收铁的机制
        1.1.2 植物体内铁的运输
        1.1.3 植物体内铁平衡的调节
    1.2 FRO家族蛋白研究进展
        1.2.1 拟南芥FRO家族蛋白研究进展
        1.2.2 番茄FRO家族蛋白研究进展
        1.2.3 大豆FRO家族蛋白研究进展
        1.2.4 水稻FRO家族蛋白研究进展
        1.2.5 其他FRO家族蛋白研究进展
    1.3 研究目的、意义和技术路线
        1.3.1 研究目的与意义
        1.3.2 技术路线
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 玉米材料
        2.1.2 感受态与载体
        2.1.3 引物合成及DNA测序
    2.2 试剂与仪器
        2.2.1 主要化学试剂
        2.2.2 主要仪器
    2.3 培养堆的配制
        2.3.1 LB大肠杆菌培养基
        2.3.2 YEB农杆菌培养基
        2.3.3 转化玉米所用培养基
    2.4 溶液的配制
        2.4.1 抗生素及缓冲液
        2.4.2 质粒DNA小量提取溶液
        2.4.3 玉米叶肉原生质体制备所需溶液
        2.4.4 检测玉米根部铁还原酶活力所需溶液
        2.4.5 去除玉米根部附着铁所需溶液
    2.5 试验所用引物
    2.6 玉米材料的种植
        2.6.1 用于Real-time RT-PCR分析的玉米材料
        2.6.2 用于叶肉原生质体制备与转化玉米材料
        2.6.3 用于铁还原酶活力测定的玉米材料
        2.6.4 用于锌铁含量测定的玉米材料
        2.6.5 用于农艺性状调查的玉米材料
    2.7 研究方法
        2.7.1 生物信息学分析
        2.7.2 玉米总RNA的提取
        2.7.3 cDNA的合成
        2.7.4 Real-time RT-PCR分析表达量
        2.7.5 目的基因的扩增
        2.7.6 目的基因的回收
        2.7.7 连接
        2.7.8 转化大肠杆菌
        2.7.9 转化农杆菌
        2.7.10 小量提取质粒DNA
        2.7.11 大量提取质粒DNA
        2.7.12 ZmFRO2的克隆
        2.7.13 融合表达载体的构建
        2.7.14 玉米叶肉原生质体的制备与转化
        2.7.15 过表达ZmFRO2载体的构建
        2.7.16 农杆菌介导的玉米遗传转化
        2.7.17 玉米根部铁还原酶活力的测定
        2.7.18 玉米根、叶及籽粒中锌铁含量的测定
        2.7.19 玉米农艺性状的调查
3 结果与分析
    3.1 ZmFRO2基因的生物信息学分析
        3.1.1 氨基酸序列比对分析
        3.1.2 系统进化树分析
    3.2 ZmFRO2基因的克隆及表达模式
        3.2.1 ZmFRO2基因的克隆
        3.2.2 田间表达模式
        3.2.3 缺铁处理表达模式
    3.3 融合表达载体的构建
    3.4 ZmFRO2在玉米叶肉原生质体中的定位
    3.5 过表达载体的构建
    3.6 ZmFRO2过表达玉米植株的获得与鉴定
    3.7 转基因玉米根部铁还原酶活力
    3.8 转基因玉米锌铁含量
    3.9 转基因玉米农艺性状
        3.9.1 拔节期SPAD值和株高
        3.9.2 成熟后株高和穗部性状
4 讨论
    4.1 ZmFRO2分子及表达特性
    4.2 ZmFRO2的生理功能
    4.3 ZmFRO2的利用价值
5 结论
参考文献
在读期间发表论文
作者简历
致谢
附件



本文编号：3772868