放线菌和矮牵牛BAC文库的构建及相关基因的筛选
发布时间：2023-03-31 18:11
细菌人工染色体文库是生物基因组研究的重要资源,它们被成功地应用于图位克隆,构建物理图谱以及全基因组测序。本研究工作由两部分组成:1.放线菌BAC载体改造及放线菌0026 BAC文库构建;2.矮牵牛BAC文库构建及相关基因筛选。放线菌(Actinomycetes)产生的次级代谢产物在医药和学术研究上有着重要意义。常用于构建放线菌BAC(Bacterial artificial chromosome)文库的载体为pMSBBACs,用其构建的放线菌BAC文库在进行质量检测时存在一定的缺陷。本研究通过在放线菌复合载体pMSBBACs中引入归位内切酶I-SceI位点,改造出适用于放线菌属大片段基因组DNA克隆和异源表达的pHZAUBACFXJ1复合载体。pHZAUBACFXJ1载体不仅在构建放线菌文库方面简单实用,在验证文库质量时用I-Sce I代替NotI进行酶切,也方便放线菌BAC文库外源插入片段大小的计算,评估放线菌BAC文库质量。本研究使用pHZAUBACFXJ1复合载体成功构建了一个放线菌0026的BAC文库。该文库总计3,456个克隆,保存在9块384板中,随机挑拣40个放线菌BAC...
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 克隆载体的发展
1.3 BAC载体的发展
1.3.1 pBAC108L克隆载体
1.3.2 pCUGIBAC1克隆载体
1.3.3 pHZAUBAC1克隆载体
1.3.4 pMSBBACs克隆载体
1.4 BAC文库简介与应用
1.5 研究目的
2 材料与方法
2.1 材料
2.2 主要试剂及配制方法
2.3 主要实验仪器
2.4 实验方法
2.4.1 放线菌BAC载体改造及放线菌0026 BAC文库构建
2.4.1.1 放线菌pHZAUBACFXJ1载体改造
2.4.1.2 pHZAUBACFXJ1 BAC载体制备
2.4.1.3 放线菌0026基因组DNA plug的制备
2.4.1.4 放线菌0026基因组DNA plug的预电泳
2.4.1.5 放线菌0026基因组DNA的预先部分酶切
2.4.1.6 放线菌0026大片段DNA的2次筛选
2.4.1.7 连接、脱盐、预转化与检测
2.4.1.8 放线菌文库质量的检测
2.4.1.9 放线菌BAC文库的复制和混合池构建
2.4.2 矮牵牛BAC文库构建及相关基因筛选
2.4.2.1 BAC载体pIndigoBAC536-S制备
2.4.2.2 HMW矮牵牛大片段基因组DNA的制备
2.4.2.3 寻找矮牵牛基因组DNA部分酶切的最适合条件
2.4.2.4 合适大小的矮牵牛基因组DNA的获得
2.4.2.5 矮牵牛基因组DNA的连接
2.4.2.6 脱盐、预转化、插入片段大小检测
2.4.2.7 大量转化、挑拣单克隆
2.4.2.8 矮牵牛BAC文库的鉴定
2.4.2.9 矮牵牛BAC文库的复制
2.4.2.10 矮牵牛BAC文库的基因筛选
3 结果与分析
3.1 放线菌BAC载体改造及放线菌0026BAC文库构建
3.1.1 放线菌pHZAUBACFXJ1载体的改造
3.1.2 放线菌pHZAUBACFXJ1-s质粒载体的制备
3.1.3 放线菌0026基因组DNAplug的制备
3.1.4 放线菌0026基因组DNA的预电泳与部分酶切
3.1.5 放线菌0026大片段DNA的两次筛选
3.1.6 大片段DNA的电洗脱回收与检测
3.1.7 放线菌大片段DNA的连接、脱盐与预转化
3.2 矮牵牛BAC文库构建及相关基因筛选
3.2.1 HMW矮牵牛大片段基因组DNA的制备
3.2.2 寻找矮牵牛基因组DNA部分酶切的最适合条件
3.2.3 合适大小的矮牵牛基因组DNA的获得
3.2.4 脱盐、预转化、插入片段大小检测
3.2.5 大量转化、挑拣单克隆
3.2.6 矮牵牛BAC文库的鉴定
3.2.7 矮牵牛BAC文库基因筛选
3.2.7.1 一级混合池构建与PCR筛选
3.2.7.2 二级混合池构建与PCR筛选
4 讨论
4.1 关于高质量的大片段外源DNA的获取
4.2 关于放线菌BAC载体的改造
4.3 关于放线菌BAC文库的构建
4.4 关于矮牵牛重瓣花BAC文库的构建
4.5 关于矮牵牛BAC文库基因筛选
参考文献
附录 A 实验部分试剂配方
附录 B BAC质粒提取步骤
附录 C 基因筛选引物信息
致谢
本文编号：3775552
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
1.1 研究问题的由来
1.2 克隆载体的发展
1.3 BAC载体的发展
1.3.1 pBAC108L克隆载体
1.3.2 pCUGIBAC1克隆载体
1.3.3 pHZAUBAC1克隆载体
1.3.4 pMSBBACs克隆载体
1.4 BAC文库简介与应用
1.5 研究目的
2 材料与方法
2.1 材料
2.2 主要试剂及配制方法
2.3 主要实验仪器
2.4 实验方法
2.4.1 放线菌BAC载体改造及放线菌0026 BAC文库构建
2.4.1.1 放线菌pHZAUBACFXJ1载体改造
2.4.1.2 pHZAUBACFXJ1 BAC载体制备
2.4.1.3 放线菌0026基因组DNA plug的制备
2.4.1.4 放线菌0026基因组DNA plug的预电泳
2.4.1.5 放线菌0026基因组DNA的预先部分酶切
2.4.1.6 放线菌0026大片段DNA的2次筛选
2.4.1.7 连接、脱盐、预转化与检测
2.4.1.8 放线菌文库质量的检测
2.4.1.9 放线菌BAC文库的复制和混合池构建
2.4.2 矮牵牛BAC文库构建及相关基因筛选
2.4.2.1 BAC载体pIndigoBAC536-S制备
2.4.2.2 HMW矮牵牛大片段基因组DNA的制备
2.4.2.3 寻找矮牵牛基因组DNA部分酶切的最适合条件
2.4.2.4 合适大小的矮牵牛基因组DNA的获得
2.4.2.5 矮牵牛基因组DNA的连接
2.4.2.6 脱盐、预转化、插入片段大小检测
2.4.2.7 大量转化、挑拣单克隆
2.4.2.8 矮牵牛BAC文库的鉴定
2.4.2.9 矮牵牛BAC文库的复制
2.4.2.10 矮牵牛BAC文库的基因筛选
3 结果与分析
3.1 放线菌BAC载体改造及放线菌0026BAC文库构建
3.1.1 放线菌pHZAUBACFXJ1载体的改造
3.1.2 放线菌pHZAUBACFXJ1-s质粒载体的制备
3.1.3 放线菌0026基因组DNAplug的制备
3.1.4 放线菌0026基因组DNA的预电泳与部分酶切
3.1.5 放线菌0026大片段DNA的两次筛选
3.1.6 大片段DNA的电洗脱回收与检测
3.1.7 放线菌大片段DNA的连接、脱盐与预转化
3.2 矮牵牛BAC文库构建及相关基因筛选
3.2.1 HMW矮牵牛大片段基因组DNA的制备
3.2.2 寻找矮牵牛基因组DNA部分酶切的最适合条件
3.2.3 合适大小的矮牵牛基因组DNA的获得
3.2.4 脱盐、预转化、插入片段大小检测
3.2.5 大量转化、挑拣单克隆
3.2.6 矮牵牛BAC文库的鉴定
3.2.7 矮牵牛BAC文库基因筛选
3.2.7.1 一级混合池构建与PCR筛选
3.2.7.2 二级混合池构建与PCR筛选
4 讨论
4.1 关于高质量的大片段外源DNA的获取
4.2 关于放线菌BAC载体的改造
4.3 关于放线菌BAC文库的构建
4.4 关于矮牵牛重瓣花BAC文库的构建
4.5 关于矮牵牛BAC文库基因筛选
参考文献
附录 A 实验部分试剂配方
附录 B BAC质粒提取步骤
附录 C 基因筛选引物信息
致谢
本文编号：3775552
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3775552.html
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