α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和双功能β-木糖苷酶/α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶基因的克隆与表征

发布时间：2023-04-02 18:37

　　人参皂苷(Ginsenosides)属于三萜皂苷类化合物,是人参属植物中最主要的活性成分,具有抗肿瘤、抗氧化以及调节免疫力等多种药理作用。人参皂苷Rd是原人参二醇型皂苷在人体肠道内的主要代谢产物之一,对心脑血管、神经以及免疫系统具有独特的药效功能;同时人参皂苷Rd还是转化Rb1、Rb₂、Rb3和Rc为高活性稀有人参皂苷C-K的中间体。由于人参皂苷Rd在人参属植物中含量较低,通过直接从植物中提取Rd的方法难以满足其实际应用。利用特定的糖苷水解酶可以水解人参皂苷主要成分(如:人参皂苷Rb1、Rb₂、Rb3、Rc)C-20位外侧糖基获得人参皂苷Rd。本论文从实验室前期分离获得的一株纤维菌属(Cellulosimicrobium aquatile Lyp51)中克隆到一个α-L-阿拉伯咲喃糖苷酶(EC3.2.1.55)基因和一个双功能β-木糖苷酶(3.2.1.37)/α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶基因,在Escherichiacoli BL211(DE3)中进行异源重组表达、并对重组蛋白进行了纯化、酶学性质研究和人参皂苷转化。利用Ni²⁺

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1 课题研究的目的与意义
        1.1 原人参二醇型皂苷
        1.2 人参皂苷Rd的药理活性与生物转化
        1.3 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶研究进展
        1.4 双功能β-木糖苷酶/α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶研究进展
        1.5 融合蛋白研究概述
        1.6 重叠延伸PCR技术简介
    2 研究思路
        2.1 本研究技术路线
        2.2 本课题研究内容
第二章 糖苷水解酶基因的克隆表达
    1 实验材料
        1.1 实验培养基与试剂
        1.2 实验菌株与质粒
    2 实验方法
        2.1 目的基因克隆
        2.2 目的基因的表达与纯化
        2.3 蛋白浓度检测
        2.4 酶活性检测
    3 实验结果与分析
        3.1 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(CaAraf51)的克隆表达
        3.2 双功能β-木糖苷酶/α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶(Xylarap51)基因的克隆表达
第三章 重组酶的酶学性质研究及应用
    1 实验材料、仪器、试剂
        1.1 实验材料和试剂
        1.2 实验仪器
    2 实验方法
        2.1 酶的最适pH和pH稳定性
        2.2 酶最适温度与温度稳定性
        2.3 化学试剂与金属离子对酶活性影响
        2.4 酶对乙醇以及糖的耐受性
        2.5 酶的底物特异性
        2.6 酶动力学常数K_m和V_max的测定
        2.7 人参皂苷Rd的分析方法
    3 实验结果与分析
        3.1 重组CaAraf51的特性
        3.2 Xylarap51的底物特异性
第四章 融合表达
    1 实验材料、仪器与试剂
    2 实验方法
        2.1 重组质粒的提取
        2.2 带有同源片段的目的基因扩增
        2.3 融合基因的构建与克隆
        2.4 融合基因的表达
        2.5 融合蛋白酶活性检测
    3 实验结果与分析
        3.1 融合基因
        3.2 融合基因的克隆
        3.3 融合基因的表达
        3.4 融合蛋白活性检测
        3.5 结论
第五章 结论与展望
    1 总结
    2 创新点
    3 展望
附录
参考文献
致谢



本文编号：3779737