S1DNMT2基因RNAi表达载体构建及其功能分析

发布时间：2023-04-05 08:28

　　植物在生长发育过程中可能受到一定的生物胁迫与非生物胁迫。植物响应非生物胁迫时发生一系列生理生化反应,以适应不同的环境变化。DNMTs是植株DNA甲基化过程中重要的甲基转移酶。目前关于植物体内DNA甲基过程中DNMT2的作用机制和功能性分析实验研究较少,因此,研究DNMT2基因在植物生长发育过程中或植物抗逆性过程中的功能和作用,对提高作物抗性和品质具有重要意义。本文以模式植物番茄(Solanum lycopersicum)为实验材料,通过NCBI数据库比对获得11种物种中DNMT2蛋白的氨基酸序列,然后通过DNMAN软件进行蛋白质保守域的分析,发现这些氨基酸序列具有相对比较保守的蛋白结构域。对这11种蛋白质氨基酸序列进行进化树分析和DNA甲基化结构域分析,结果表明番茄SlDNMT2蛋白与马铃薯St DNMT2蛋白的亲缘关系较近,同源性高达95.54%。同时构建SlDNMT2的多个植物表达载体进行一系列生理生化分析。首先,构建表达绿色荧光蛋白的融合表达载体p ART27-SlDNMT2-e GFP观察SlDNMT2蛋白的亚细胞定位情况,结果表明SlDNMT2蛋白定位于细胞核中。利用植物基因...

【文章页数】：105 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 DNA甲基化
        1.1.1 植物DNA甲基化的概念
        1.1.2 DNA甲基化作用的关键酶—DNA甲基转移酶
        1.1.3 DNA甲基化应用及其前景
    1.2 植物抗逆性研究
        1.2.1 生物胁迫与非生物胁迫
        1.2.2 植物抗逆性的研究进展与意义
    1.3 转基因番茄的研究现状
    1.4 RNA干扰技术在植物基因组学中的应用
        1.4.1 RNA干扰技术的概念
        1.4.2 RNA干扰技术要点及其应用
    1.5 农杆菌介导法及其在基因工程中的应用
        1.5.1 农杆菌介导的转化机理
        1.5.2 农杆菌介导法影响因素
        1.5.3 农杆菌介导法应用前景
    1.6 植物组培及其在基因组学中的应用
        1.6.1 植物组培的概念
        1.6.2 植物组培的关键要素及其应用前景
    1.7 植物蛋白亚细胞定位及其在基因工程中的应用
        1.7.1 亚细胞定位的概念和机理
        1.7.2 亚细胞定位的应用前景
    1.8 本实验研究相关内容
第二章 实验材料与方法
    2.1 材料与仪器设备
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株与质粒
        2.1.3 相关引物信息
    2.2 实验中主要仪器设备
        2.2.1 本实验中主要仪器
        2.2.2 实验器皿
    2.3 实验相关试剂
        2.3.1 本实验中涉及的相关酶
        2.3.2 本实验中涉及的相关化学试剂
    2.4 本实验中常用的试剂耗材
    2.5 相关试剂和培养基的配制
        2.5.1 分子实验中相关培养基的配制
        2.5.2 分子实验中相关试剂的配制
        2.5.3 植物组织培养中常用试剂的配制
        2.5.4 植物组织培养中相关植物激素的配制
        2.5.5 植物组织培养中相关培养基的配制
        2.5.6 瞬时表达系统相关试剂的配置
    2.6 相关引物设计
        2.6.1 引物设计原则
        2.6.2 引物设计基本步骤
    2.7 植株总RNA提取
    2.8 反转录获得cDNA
        2.8.1 反转录反应体系
        2.8.2 逆转录PCR扩增程序
    2.9 SlDNMT2 扩增
        2.9.1 SlDNMT2 PCR反应体系
        2.9.2 SlDNMT2 PCR反应程序
    2.10 番茄RNAi表达载体的构建
        2.10.1 特异性片段siRNA1的克隆
            2.10.1.5 实验步骤
        2.10.2 si RNA1与p SK载体的酶切、连接
        2.10.3 特异性片段siRNA1阳性鉴定
        2.10.4 特异性片段siRNA2克隆
        2.10.5 特异性片段siRNA2阳性鉴定
        2.10.6 p SK-si RNA重组质粒鉴定
        2.10.7 p SK-si RNA质粒快提检测
        2.10.8 重组质粒的发夹结构的验证
        2.10.9 重组质粒的切胶回收
        2.10.10 SlDNMT2-si RNA与 p BI121 连接
    2.11 SlDNMT2 亚细胞定位
        2.11.1 融合表达载体构建
        2.11.2 烟草瞬时表达
    2.12 SlDNMT2 组织特异性表达分析
    2.13 番茄植株的遗传转化
        2.13.1 大肠杆菌DH5α的制备
        2.13.2 制备农杆菌感受态(CaCl2法)
        2.13.3 PCR产物或酶切产物纯化
        2.13.4 SlDNMT2 与中间载体连接
        2.13.5 连接产物转化大肠杆菌
        2.13.6 菌落PCR鉴定
        2.13.7 SlDNMT2 酶切鉴定
        2.13.8 SlDNMT2 测序和序列分析
        2.13.9 p BI121-SlDNMT2-si RNA转化农杆菌
        2.13.10 农杆菌单克隆阳性鉴定
    2.14 植物组织培养实验
        2.14.1 发种子
        2.14.2 预培养
        2.14.3 农杆菌侵染与共培养
        2.14.4 筛选培养
        2.14.5 生根培养
    2.15 炼苗与移栽
    2.16 DNA水平的阳性鉴定
    2.17 RNA水平的阳性鉴定
        2.17.1 定量PCR组分
        2.17.2 定量PCR反应程序
        2.17.3 实验步骤
    2.18 非生物胁迫下的表型分析
        2.18.1 鲜重分析
        2.18.2 植株高度分析
        2.18.3 植株侧根数分析
        2.18.4 气孔数分析
第三章 实验结果与分析
    3.1 SlDNMT2 生物信息学分析
    3.2 SlDNMT2 基因c DNA序列克隆
    3.3 SlDNMT2 表达模式分析
    3.4 SlDNMT2 亚细胞定位分析
    3.5 SlDNMT2 特异性片段si RNA克隆
    3.6 siRNA1特异性序列阳性鉴定
    3.7 siRNA2特异性序列阳性鉴定
    3.8 发夹结构的验证
    3.9 SlDNMT2 RNAi表达载体正确性检测
    3.10 预培养
    3.11 共培养
    3.12 K60筛选培养
    3.13 K65筛选培养
    3.14 K70筛选培养
    3.15 生根培养
    3.16 转基因植株DNA水平的阳性鉴定
    3.17 转基因植株RNA水平的定量分析
    3.18 盐胁迫条件下的表型分析
    3.19 甘露醇胁迫条件下的表型分析
    3.20 二价重金属离子胁迫时的表型分析
    3.21 干旱环境下转基因植物的表型分析
    3.22 转基因植物叶片中气孔情况的分析
    3.23 番茄中Sl TINY1、Sl SAG1 基因半定量分析
第四章 结果与讨论
    4.1 实验结论
    4.2 展望与讨论
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况



本文编号：3783090