肠毒素性大肠杆菌的RFP基因特异性标记及表达研究

发布时间：2023-04-23 06:18

　　在益生菌的选育、体内效价评定以及作用机制研究中,建立肠道攻毒模型可以提供一种有效的手段,即采用特定的病原菌,建立其特异性标记和检测方法,用于体内示踪和分布的研究。常规的模型以绿色荧光蛋白标记及特异性检测居多,但存在菌株遗传稳定性差、检测特异性不强等问题,尤其受到体内背景荧光干扰大的影响,测定结果准确性不高。本研究以肠毒性大肠杆菌作为通用病原菌,采用红色荧光蛋白标记的方法,尝试应用不同的分子标记模式,拟构建出荧光表达稳定、特异性更强的荧光标记菌株,为进一步建立病原菌的攻毒模型奠定菌株和方法学基础。具体研究内容和相关结果如下:(1)选择红色荧光蛋白mKate和mCherry作为报告基因,分别连入3种常见表达载体pET-28a、pET-9a和pQE30,得到6种重组质粒并分别转化至感受态细胞TOP10中。在无诱导剂的条件下,成功筛选得到两种重组质粒pQE30-mKate,pQE30-mCherry,其转化菌株菌落呈现明显红色。以这两种重组质粒为基础,进一步分别化转到不同类型的肠毒性大肠杆菌细胞(E.coli K88ab、E.coli K88ac、E.coli K99和E.coli 987P)...

【文章页数】：106 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 产肠毒素性大肠杆菌的研究概况
    1.2 ETEC的毒力因子及致病机制
        1.2.1 黏附素
        1.2.2 肠毒素
    1.3 ETEC的防治措施
    1.4 荧光标记技术
        1.4.1 荧光蛋白的结构和性质
        1.4.2 荧光蛋白的标记方式
        1.4.3 荧光蛋白的应用
    1.5 攻毒模型的研究现状
    1.6 研究意义及内容
        1.6.1 研究意义
        1.6.2 研究技术路线
        1.6.3 研究内容
第二章 RFP表达载体的构建及ETEC表达宿主的筛选
    2.1 前言
    2.2 试验材料
        2.2.1 菌株和载体
        2.2.2 培养基、工具酶和试剂
        2.2.3 仪器与设备
    2.3 试验方法
        2.3.1 基于RFP基因原核表达载体的构建
        2.3.2 RFP质粒转化宿主ETEC及阳性克隆的筛选
    2.4 结果与分析
        2.4.1 红色荧光蛋白mKate和 mCherry的 PCR扩增结果
        2.4.2 重组质粒菌落PCR鉴定
        2.4.3 重组质粒双酶切鉴定
        2.4.4 重组质粒在工程菌及ETEC中的表达
        2.4.5 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry的 PCR验证
        2.4.6 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry荧光显微镜观察
        2.4.7 重组菌E.coli K88ab/K99-mKate/mCherry荧光强度的测定
        2.4.8 重组菌E.coli K99-mCherry的分子鉴定
        2.4.9 重组菌E.coli K99-mCherry和菌株E.coli K99 生长曲线比较
        2.4.10 重组菌E.coli K99-mCherry中 mCherry基因表达稳定性测定
        2.4.11 荧光体系下E.coli K99-mCherry活菌浓度检测标准曲线的建立
    2.5 讨论
    2.6 小结
第三章 基因剂量对RFP标记ETEC的影响
    3.1 前言
    3.2 试验材料
        3.2.1 菌株和载体
        3.2.2 培养基、工具酶和试剂
        3.2.3 仪器与设备
    3.3 试验方法
        3.3.1 多拷贝红色荧光蛋白mCherry重组质粒的构建
        3.3.2 多拷贝重组质粒的转化E.coli K99 及荧光强度的测定
    3.4 结果与分析
        3.4.1 双拷贝重组质粒酶切鉴定
        3.4.2 多拷贝菌株的荧光强度测定与比较
    3.5 讨论
    3.6 小结
第四章 基于表面展示系统的ETEC-RFP特异性标记
    4.1 前言
    4.2 试验材料
        4.2.1 菌株和载体
        4.2.2 培养基、工具酶和试剂
        4.2.3 仪器与设备
    4.3 试验方法
        4.3.1 大肠杆菌表面展示表达载体的构建
        4.3.2 E.coli K99 表面展示融合蛋白Lpp’OmpA-mCherry
    4.4 结果和分析
        4.4.1 PCR扩增结果
        4.4.2 重组质粒pLpp’OmpA双酶切鉴定
        4.4.3 重组质粒pLpp’OmpA-mCherry双酶切鉴定
        4.4.4 重组菌的双酶切鉴定
        4.4.5 重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry的分子鉴定
        4.4.6 重组菌E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry荧光显微镜观察
        4.4.7 E.coli K99 表面展示mCherry的生物活性检测
        4.4.8 E.coli K99 表面展示mCherry的表达稳定性检测
        4.4.9 荧光体系下E.coli K99-Lpp’OmpA-mCherry活菌浓度检测标准曲线的建立
    4.5 讨论
    4.6 小结
第五章 基于CRISPR/Cas9 系统介导的ETEC-RFP特异性标记
    5.1 前言
    5.2 试验材料
        5.2.1 菌株和载体
        5.2.2 培养基、工具酶和试剂
        5.2.3 仪器与设备
    5.3 试验方法
        5.3.1 质粒DNA的制备
        5.3.2 大肠杆菌K12和K99 的基因组DNA的制备
        5.3.3 大肠杆菌K99和DH5α感受态细胞的制备
        5.3.4 基因敲入位点的选择
        5.3.5 sgRNA的设计及基因编辑载体的构建
        5.3.6 基因编辑菌株的筛选及基因编辑载体的去除
        5.3.7 基因编辑菌株的荧光检测
        5.3.8 基因编辑菌株分子背景鉴定
        5.3.9 诱导剂对基因编辑菌株红色荧光蛋白表达的影响
        5.3.10 基因编辑菌株生长特性曲线测定
        5.3.11 基因编辑菌株稳定性的测定
        5.3.12 荧光体系下基因编辑菌株活菌浓度标准曲线的建立
    5.4 结果与分析
        5.4.1 假基因位点的选择和验证
        5.4.2 mCherry基因编辑菌株的构建及鉴定
        5.4.3 基因编辑质粒的去除
        5.4.4 基因编辑菌株荧光显微镜观察
        5.4.5 基因编辑菌株的分子鉴定
        5.4.6 不同诱导剂及其浓度对荧光蛋白表达量的影响
        5.4.7 基因编辑菌株的生物活性检测
        5.4.8 基因编辑菌株中mCherry的表达稳定性检测
        5.4.9 荧光体系下基因编辑菌株活菌浓度检测标准曲线的建立
    5.5 讨论
    5.6 小结
第六章 ETEC-RFP标记菌株的综合评价及其在大鼠胃肠道样品中特异性荧光检测
    6.1 前言
    6.2 试验材料
        6.2.1 菌株和试剂
        6.2.2 实验动物
        6.2.3 仪器与设备
    6.3 试验方法
        6.3.1 不同标记方法中mCherry基因表达稳定性的比较
        6.3.2 胃肠道内容物样品处理方法
        6.3.3 胃肠道内容物的荧光特异性检测
        6.3.4 统计分析
    6.4 结果与分析
        6.4.1 标记菌株mCherry基因表达稳定性的比较
        6.4.2 大鼠不同胃肠段内容物对荧光检测的干扰
    6.5 讨论
    6.6 小结
结论
参考文献
附录A 攻读硕士学位期间发表的论文
附录B 基因编辑的序列
致谢



本文编号：3799267