梨棕榈酰基转移酶基因家族鉴定及PbPAT14功能研究

发布时间：2023-04-23 13:21

　　棕榈酰基转移酶(Palmitoyl Transferases,PATs)是植物中一类重要的蛋白质翻译后修饰酶,在蛋白质棕榈酰化修饰过程中发挥着关键的作用。研究表明,PATs在真核生物中具有广泛的细胞功能,对植物的生长发育、器官形成、生殖发育及胁迫响应等生命活动具有重要的调控作用。因此,PATs功能的发掘为植物株型构建、增产增收以及品质改良等分子设计育种工作提供了新的研究思路和基因资源。目前,我国梨栽培生产中还没有有效的梨矮化砧木,探索分析梨中具有矮化潜力的PATs功能,有助于揭示砧木矮化机理,对加快我国梨产业现代化转型升级,实现矮化栽培模式具有重要的意义。本研究利用生物信息学方法对编码PATs蛋白的梨PbDHHC基因家族进行了分析鉴定,以杜梨(Pyrus betulifolia)为研究试材,利用CRISPR/Cas9基因编辑对PbPAT14基因进行敲除获得杜梨矮生突变体,从生长指标、微观结构、内源激素含量、基因表达模式以及互作蛋白筛选等角度对杜梨突变体进行深入剖析,旨在阐释杜梨矮生突变体的矮生机理,为进一步揭示砧木矮化机理提供理论依据。主要研究结果如下:1、全基因组水平从梨(Pyrus...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词表
引言
    1 研究背景和意义
    2 梨矮化砧木的选育及应用
        2.1 梨异属矮化砧木
        2.2 梨属矮化砧木
    3 砧木矮化机理研究进展
        3.1 矮化砧木激素代谢特征
        3.2 矮化砧木致矮相关的遗传标记
        3.3 存在的问题及展望
    4 蛋白质棕榈酰化修饰研究进展
        4.1 蛋白质的翻译后修饰
        4.2 蛋白质棕榈酰化修饰
        4.3 蛋白质棕榈酰化修饰在植物中的作用
        4.4 棕榈酰基转移酶
        4.5 植物中的棕榈酰基转移酶
        4.6 棕榈酰基转移酶表达模式研究
        4.7 棕榈酰基转移酶修饰底物的鉴定
        4.8 蛋白质的去棕榈酰化
        4.9 研究植物棕榈酰基转移酶及其底物的方法
    5 基因编辑技术研究进展
        5.1 常用的基因编辑技术
        5.2 CRISPR/Cas9系统的发现与建立
        5.3 CRISPR/Cas9系统在植物中的应用范围及作用机理
        5.4 CRISPR/Cas9技术在果树育种中的应用
        5.5 CRISPR/Cas9基因编辑靶点分析方法
        5.6 CRISPR/Cas9系统存在的问题及发展方向
第一章 梨棕榈酰基转移酶基因家族鉴定及分析
    1 材料与方法
        1.1 数据库信息
        1.2 梨PbDHHC基因家族的鉴定
        1.3 梨PbDHHCs基因结构分析和蛋白结构域预测
        1.4 梨PbDHHCs基因染色体定位和共线性分析
        1.5 梨PbDHHCs同源进化分析和DHHC结构域保守序列分析
        1.6 梨PbDHHCs基因启动子顺式作用元件和表达模式分析
    2 结果与分析
        2.1 梨PbDHHC基因家族鉴定
        2.2 梨PbDHHCs基因染色体定位及共线性分析
        2.3 梨PbDHHCs与其他物种DHHC基因同源进化关系
        2.4 梨PbDHHCs基因结构及蛋白结构域分析
        2.5 梨PbDHHCs基因启动子及表达模式分析
    3 讨论
    4 小结
第二章 梨PbPAT14基因克隆及酶活性验证
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 试剂与仪器
        1.3 杜梨组织总RNA提取方法
        1.4 杜梨总RNA质量检测
        1.5 cDNA反转录合成
        1.6 梨中PbPAT14鉴定及基因克隆
        1.7 Gateway系统入门载体及表达载体构建
        1.8 酵母和拟南芥转化及阳性筛选
        1.9 梨PbPAT14酶活性及自身棕榈酰化功能验证
    2 结果与分析
        2.1 杜梨总RNA质量检测
        2.2 梨PbPAT14鉴定及酶活性验证
        2.3 梨PbPAT14棕榈酰化功能位点验证
        2.4 梨PbPAT14自身棕榈酰化修饰功能验证
    3 讨论
    4 小结
第三章 杜梨遗传转化及突变体验证
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 试剂与仪器
        1.3 杜梨基因组DNA的提取
        1.4 梨PbPAT14基因靶点选择
        1.5 CRISPR/Cas9载体构建及验证
        1.6 杜梨组培苗对潮霉素的敏感试验
        1.7 农杆菌介导的杜梨遗传转化
        1.8 杜梨PbPAT14基因编辑效果检测
        1.9 脱靶位点检测
    2 结果与分析
        2.1 梨PbPAT14基因靶点选择
        2.2 基因编辑载体构建
        2.3 潮霉素对杜梨组培苗致死浓度筛选
        2.4 杜梨遗传转化
        2.5 转基因植株阳性检测
        2.6 转基因植株基因编辑效果检测
        2.7 脱靶位点检测
    3 讨论
    4 小结
第四章 杜梨PbPAT14功能缺失突变体矮生机理初探
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 试剂与仪器
        1.3 植株生长指标测定
        1.4 石蜡切片制作
        1.5 激素测定
        1.6 实时荧光定量PCR
    2 结果与分析
        2.1 杜梨突变体生长表型分析
        2.2 杜梨突变体茎和叶片的微观结构观察
        2.3 杜梨突变体内源激素含量测定及qRT PCR分析
        2.4 梨PbPAT14蛋白修饰底物筛选及分析
    3 讨论
    4 小结
全文结论
参考文献
附录
作者简介
致谢



本文编号：3799801