洋葱果胶甲酯酶基因AcPME的克
发布时间：2023-04-23 13:50
洋葱(Allium cepa L.)在分类学上属于天门冬目石蒜科葱亚科葱属(APGIII)蔬菜作物,广泛栽培于世界各地。因其基因组巨大(15,290 Mbp/C),分子生物学基础领域的研究相对薄弱,主要集中在育性、颜色相关基因的分子标记上,而关于洋葱功能基因的研究甚少。果胶甲酯酶[pectin methylesterase,PME]是一类催化果胶复合物中甲酯化的D-半乳糖醛酸单元去甲酯化的一类细胞壁蛋白,根据其保守的结构域该酶组成了一个巨大的基因家族,在植物不同的生长发育阶段及其不同的生理过程中,通过作用于细胞壁而发挥作用。已有的研究发现,果胶甲酯酶参与了多种生理过程,如果实成熟、器官脱落、小孢子发育和花粉管伸长、种子萌发、抗病性、形成层细胞分化等。本试验在研究洋葱育性相关基因差异表达的过程中,发现了一个大小约为350 bp的差异表达片段始终只在可育材料中出现,克隆了其编码序列。蛋白质序列比对显示,该基因表达的蛋白具有果胶甲酯酶结构域,属于果胶甲酯酶超家族成员。本研究以洋葱育性恢复系12-10(S,MsMs)为研究材料,利用基因克隆、序列分析、原核表达、生物活性分析及基因枪技术转化洋葱...
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
ABSTRACT
1 引言
1.1 果胶甲酯酶研究进展
1.1.1 果胶甲酯酶的发现
1.1.2 果胶甲酯酶的结构与分类
1.1.3 果胶甲酯酶的作用机制
1.1.4 果胶甲酯酶与植物花粉发育
1.2 果胶甲酯酶抑制剂（PMEI）
1.3 果胶甲酯酶的原核表达与活性分析
1.4 蛋白质亚细胞定位研究
1.4.1 蛋白质亚细胞定位研究意义
1.4.2 蛋白质亚细胞定位研究方法
1.5 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株
2.1.3 载体与质粒
2.1.4 主要试剂
2.1.5 仪器设备
2.1.6 PCR引物的合成
2.2 方法
2.2.1 洋葱总DNA的提取
2.2.2 洋葱总RNA的提取
2.2.3 电泳检测
2.2.4 胶回收与PCR产物纯化
2.2.5 PCR产物的连接、转化及蓝白板筛选
2.2.6 质粒DNA提取
2.2.7 测序与序列分析
2.2.8 洋葱AcPME基因的克隆
2.2.8.1 cDNA第一条链的合成
2.2.8.2 cDNA末端扩增（3ˊ和 5ˊRACE）
2.2.8.3 AcPME基因全长DNA和m RNA的获得
2.2.9 洋葱AcPME/AcPMEI基因的原核表达
2.2.9.1 PME、PMEI和PMEI-PME片段的扩增
2.2.9.2 基于pGEX4T-1 和pET24a系列的原核表达载体及工程菌的构建
2.2.9.3 基于pGEX4T-1 和pET24a系列重组质粒的蛋白质表达初探
2.2.9.4 SDS-PAGE电泳检测
2.2.9.5 pGEX4T1PME/pET24a-PMEI蛋白表达条件的优化
2.2.9.6 pGEX4T1PME/pET24a-PMEI蛋白质诱导大量表达
2.2.9.7 pGEX4T1PME蛋白纯化
2.2.9.8 pET24a-PMEI蛋白纯化
2.2.10 生物活性分析
2.2.11 洋葱AcPME蛋白亚细胞定位
2.2.11.1 烟草叶片瞬时表达
2.2.11.2 转基因拟南芥根尖细胞定位
2.2.11.3 洋葱基因枪瞬时表达
2.2.11.4 荧光观察
3 结果与分析
3.1 洋葱总DNA和RNA提取结果
3.2 洋葱ACPME基因的克隆
3.2.1 洋葱AcPME基因 3ˊ、5ˊRACE及全长DNA和cDNA的扩增
3.2.2 AcPME基因的序列分析
3.2.3 AcPME蛋白同源比对与系统进化
3.2.4 AcPME蛋白进化树分析及三维结构图
3.3 洋葱ACPME/ACPMEI基因的原核表达
3.3.1 原核表达载体构建
3.3.2 目的蛋白诱导表达
3.3.2.1 目的蛋白的小量表达
3.3.2.2 目的蛋白存在形式
3.3.3 目的蛋白表达条件的优化
3.3.3.1 pGEX4T1PME蛋白表达条件的优化
3.3.3.2 pET 24a-PMEI蛋白表达条件的优化
3.3.4 目的蛋白纯化
3.3.4.1 pGEX4T1PME蛋白纯化
3.3.4.2 pET 24a-PMEI蛋白纯化
3.3.5 生物活性分析
3.4 洋葱ACPME蛋白亚细胞定位
3.4.1 烟草叶片注射瞬时表达
3.4.1.1 亚细胞定位载体的获得与验证
3.4.1.2 AcPME基因在烟草中的亚细胞定位
3.4.2 洋葱AcPME蛋白在拟南芥中的定位
3.4.2.1 拟南芥的转化与筛选
3.4.2.2 转基因拟南芥植株PCR鉴定及定位
3.4.3 洋葱AcPME蛋白在洋葱表皮中的定位
3.4.3.1 洋葱表皮瞬时定位载体的获得与验证
3.4.3.2 AcPME在洋葱表皮细胞中的定位
4 讨论
4.1 ACPME基因的分类
4.2 ACPME和ACPMEI的原核表达系统
4.3 ACPME基因与洋葱育性
4.4 蛋白表达条件的优化及蛋白纯化
4.5 ACPME蛋白亚细胞定位
5 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士期间发表论文情况
本文编号：3799838
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
ABSTRACT
1 引言
1.1 果胶甲酯酶研究进展
1.1.1 果胶甲酯酶的发现
1.1.2 果胶甲酯酶的结构与分类
1.1.3 果胶甲酯酶的作用机制
1.1.4 果胶甲酯酶与植物花粉发育
1.2 果胶甲酯酶抑制剂（PMEI）
1.3 果胶甲酯酶的原核表达与活性分析
1.4 蛋白质亚细胞定位研究
1.4.1 蛋白质亚细胞定位研究意义
1.4.2 蛋白质亚细胞定位研究方法
1.5 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株
2.1.3 载体与质粒
2.1.4 主要试剂
2.1.5 仪器设备
2.1.6 PCR引物的合成
2.2 方法
2.2.1 洋葱总DNA的提取
2.2.2 洋葱总RNA的提取
2.2.3 电泳检测
2.2.4 胶回收与PCR产物纯化
2.2.5 PCR产物的连接、转化及蓝白板筛选
2.2.6 质粒DNA提取
2.2.7 测序与序列分析
2.2.8 洋葱AcPME基因的克隆
2.2.8.1 cDNA第一条链的合成
2.2.8.2 cDNA末端扩增（3ˊ和 5ˊRACE）
2.2.8.3 AcPME基因全长DNA和m RNA的获得
2.2.9 洋葱AcPME/AcPMEI基因的原核表达
2.2.9.1 PME、PMEI和PMEI-PME片段的扩增
2.2.9.2 基于pGEX4T-1 和pET24a系列的原核表达载体及工程菌的构建
2.2.9.3 基于pGEX4T-1 和pET24a系列重组质粒的蛋白质表达初探
2.2.9.4 SDS-PAGE电泳检测
2.2.9.5 pGEX4T1PME/pET24a-PMEI蛋白表达条件的优化
2.2.9.6 pGEX4T1PME/pET24a-PMEI蛋白质诱导大量表达
2.2.9.7 pGEX4T1PME蛋白纯化
2.2.9.8 pET24a-PMEI蛋白纯化
2.2.10 生物活性分析
2.2.11 洋葱AcPME蛋白亚细胞定位
2.2.11.1 烟草叶片瞬时表达
2.2.11.2 转基因拟南芥根尖细胞定位
2.2.11.3 洋葱基因枪瞬时表达
2.2.11.4 荧光观察
3 结果与分析
3.1 洋葱总DNA和RNA提取结果
3.2 洋葱ACPME基因的克隆
3.2.1 洋葱AcPME基因 3ˊ、5ˊRACE及全长DNA和cDNA的扩增
3.2.2 AcPME基因的序列分析
3.2.3 AcPME蛋白同源比对与系统进化
3.2.4 AcPME蛋白进化树分析及三维结构图
3.3 洋葱ACPME/ACPMEI基因的原核表达
3.3.1 原核表达载体构建
3.3.2 目的蛋白诱导表达
3.3.2.1 目的蛋白的小量表达
3.3.2.2 目的蛋白存在形式
3.3.3 目的蛋白表达条件的优化
3.3.3.1 pGEX4T1PME蛋白表达条件的优化
3.3.3.2 pET 24a-PMEI蛋白表达条件的优化
3.3.4 目的蛋白纯化
3.3.4.1 pGEX4T1PME蛋白纯化
3.3.4.2 pET 24a-PMEI蛋白纯化
3.3.5 生物活性分析
3.4 洋葱ACPME蛋白亚细胞定位
3.4.1 烟草叶片注射瞬时表达
3.4.1.1 亚细胞定位载体的获得与验证
3.4.1.2 AcPME基因在烟草中的亚细胞定位
3.4.2 洋葱AcPME蛋白在拟南芥中的定位
3.4.2.1 拟南芥的转化与筛选
3.4.2.2 转基因拟南芥植株PCR鉴定及定位
3.4.3 洋葱AcPME蛋白在洋葱表皮中的定位
3.4.3.1 洋葱表皮瞬时定位载体的获得与验证
3.4.3.2 AcPME在洋葱表皮细胞中的定位
4 讨论
4.1 ACPME基因的分类
4.2 ACPME和ACPMEI的原核表达系统
4.3 ACPME基因与洋葱育性
4.4 蛋白表达条件的优化及蛋白纯化
4.5 ACPME蛋白亚细胞定位
5 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士期间发表论文情况
本文编号：3799838
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3799838.html
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