溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscB基因的功能研究及vscD基因的克隆表达

发布时间：2023-05-10 00:52

　　溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)作为海洋水生经济动物的主要病原之一,给水产养殖产业造成了严重危害。因此,需对溶藻弧菌病菌进行有效的防控。Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)作为溶藻弧菌的毒力因子与其致病性关系密切,Vsc B蛋白和Vsc D蛋白是Ⅲ型分泌系统重要组成部分,可能在溶藻弧菌侵染宿主的过程发挥重要作用。本实验以溶藻弧菌T3SS的vsc B和vsc D基因作为研究对象,分别克隆了vsc B和vsc D基因,结果发现,vsc B基因长为429 bp,编码142个氨基酸,理论分子量为16.4k Da,p I值为5.48;vsc D基因长1302 bp,编码了433个氨基酸,分子量为47.9k Da,理论p I值为4.98。通过氨基酸序列同源性比对结果显示,溶藻弧菌的Vsc B与副溶血弧菌的蛋白相似度最高,达到91%,而溶藻弧菌的Vsc D与魔鬼弧菌(Vibrio diabolicus)的蛋白相似度最高,达到97%。同时分别构建了p ET-28a-vsc B和p ET-32a-vsc D原核表达载体,分别对其表达产物进行了可...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 溶藻弧菌的研究进展
        1.1.1 溶藻弧菌的主要生物学特征
        1.1.2 溶藻弧菌的致病因子
    1.2 革兰氏阴性菌的蛋白分泌系统(ProteinSecretionSystem)
    1.3 溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统(TypeIIIsecretionsystem,T3SS)
    1.4 研究目的和意义
2 vscB和vscD基因的克隆及生物信息学分析
    2.1 材料
        2.1.1 载体及菌株
        2.1.2 试剂
        2.1.3 仪器
    2.2 方法
        2.2.1 溶藻弧菌HY9901菌株基因组的抽提
        2.2.2 vscB和vscD基因的克隆
        2.2.3 目的片段与载体的连接及测序
        2.2.4 生物信息学分析方法
    2.3 结果与分析
        2.3.1 vscB和vscD基因的全长克隆
        2.3.2 VscB和VscD的理化性质
        2.3.3 VscB和VscD序列分析
        2.3.4 同源性和进化分析
        2.3.5 二级结构的预测
        2.3.6 VscB和VscD的功能域预测
        2.3.7 VscB和VscD三级结构
    2.4 讨论
3 溶藻弧菌VscB和VscD的原核表达
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 方法
        3.2.1 构建重组表达质粒
        3.2.2 融合蛋白的诱导表达
        3.2.3 表达产物VscB和VscD蛋白的纯化
        3.2.4 Westernblot检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 pET-28a-vscB和pET-32a-vscD表达载体的鉴定
        3.3.2 pET-28a-vscB和pET-32a-vscD的诱导表达
        3.3.3 表达产物VscB和VscD蛋白的可溶性分析
        3.3.4 重组蛋白VscB和VscD蛋白的纯化检测
        3.3.5 Westernblot检测
    3.4 讨论
4 缺失株△vscB与回补株的构建
    4.1 材料
        4.1.1 质粒和菌株
        4.1.2 引物
        4.1.3 试剂
        4.1.4 仪器
    4.2 方法
        4.2.1 △vscB的构建
        4.2.2 回补株vscB的构建
    4.3 结果与分析
        4.3.1 vscB缺失片段的融合
        4.3.2 pLP12-vscB重组质粒
        4.3.3 第一次同源重组
        4.3.4 第二次同源重组
        4.3.5 回补株C-vscB构建
    4.4 讨论
5 △vscB的生物学表型研究及免疫保护分析
    5.1 材料
        5.1.1 菌株和实验用鱼
        5.1.2 仪器
        5.1.3 试剂
    5.2 方法
        5.2.1 缺失株△vscB的遗传稳定性检测
        5.2.2 测定细菌的生长曲线
        5.2.3 细菌泳动实验
        5.2.4 胞外蛋白酶活性测定
        5.2.5 生物被膜测定
        5.2.6 半数致死量的测定(LD50)
        5.2.7 免疫保护率的测定
        5.2.8 统计学分析
    5.3 结果与分析
        5.3.1 缺失株△vscB的遗传稳定性
        5.3.2 HY9901、△vscB和C-vscB的生长曲线
        5.3.3 泳动实验
        5.3.4 胞外蛋白酶活性测定
        5.3.5 生物被膜测定
    5.4 讨论
6 结论
    6.1 溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscB和vscD基因的克隆
    6.2 vscB和vscD表达载体的构建
    6.3 缺失株△vscB的构建
    6.4 缺失株△vscB生物学表型研究及免疫保护分析
参考文献
致谢
作者简介
导师简介



本文编号：3812714