青天葵中独脚金内酯合成相关基因NfCCD7的克隆与表达载体的构建

发布时间：2023-05-20 07:20

　　青天葵是岭南地区常用中药材之一,具有润肺止咳、清热凉血、散瘀解毒的功效,临床上多用于治疗肺系疾病。青天葵药材原植物为兰科芋兰属植物毛唇芋兰(Nervilia fordii(Hance)Schiltr.),该植物以无性生殖为主,对生长环境要求苛刻,每株每年一般只长1²个新球茎,每个球茎只长一片叶子。因此青天葵的繁殖系数非常低,加上人类的过度采挖,其野生资源濒临灭绝,而人工栽培还远不能满足市场需求。为了青天葵中药资源的可持续利用,想方设法扩大其药用资源迫在眉睫。独脚金內酯(Strigolactones,SLs)是在2008年确认的一种具有萜内酯结构的新型植物激素,具有抑制植物分枝生长、促进侧根形成、诱导根毛伸长、叶片衰老和控制中胚轴伸长的功能,在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用。目前SLs的生物合成途径已基本研究清楚,它是以类胡萝卜素为底物,经过类胡萝卜素异构酶D27、类胡萝卜素裂解双加氧酶7、类胡萝卜素裂解双加氧酶8和细胞色素单加氧酶P450家族的CYP711A1等酶的作用逐步合成的。本课题组通过挖掘青天葵转录组数据找到了所有已报道的SLs通路的相关基因,说明S...

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
    1 研究背景
    2 本论文工作开展的整体思路
        2.1 研究依据
        2.2 研究目的及意义
        2.3 研究内容与方法
        2.4 技术路线
第一章 文献综述
    1 青天葵研究进展
        1.1 栽培和组织培养研究
        1.2 化学成分研究
        1.3 药理作用研究
        1.4 分子生物学研究
    2 独脚金内酯研究进展
        2.1 独脚金内酯的发现
        2.2 独脚金内酯的生物合成
        2.3 独脚金内酯的信号转导
        2.4 独脚金内酯的生物学作用
    3 展望
第二章 青天葵独脚金内酯合成相关基因NfCCD7的克隆
    1 实验材料与试剂
        1.1 植物材料
        1.2 试剂
        1.3 菌种及载体
        1.4 培养基与抗生素
        1.5 仪器设备
        1.6 引物与测序
    2 实验方法
        2.1 青天葵转录组Unigenes的筛选
        2.2 青天葵叶片总RNA的提取
        2.3 总RNA的质量检测
        2.4 总RNA第一链cDNA的合成
        2.5 青天葵NfCCD7的扩增
        2.6 青天葵NfCCD7cDNA全长的拼接
        2.7 青天葵NfCCD7编码区的扩增
        2.8 基因编码蛋白的分析
    3 结果与分析
        3.1 青天葵转录组Unigenes的筛选
        3.2 青天葵叶片总RNA提取
        3.3 青天葵NfCCD7cDNA全长序列的获得
        3.4 NfCCD7编码区扩增
        3.5 青天葵NfCCD7基因编码蛋白的分析
    4 讨论
第三章 NfCCD7/EGFP融合基因在烟草原生质体中的瞬时表达
    1 实验材料与试剂
        1.1 植物材料
        1.2 试剂
        1.3 菌种及载体
        1.4 培养基与抗生素
        1.5 溶液配制
        1.6 仪器设备
    2 实验方法
        2.1 融合基因表达载体的构建
        2.2 烟草原生质体的提取
        2.3 PEG介导融合基因瞬时表达
    3 结果与分析
        3.1 融合基因表达载体的构建
        3.2 融合基因的瞬时表达
    4 讨论
第四章 农杆菌介导NfCCD7转化拟南芥的初步探索
    1 实验材料与试剂
        1.1 植物材料
        1.2 试剂
        1.3 菌种及载体
        1.4 培养基与抗生素
        1.5 溶液配制
        1.6 仪器设备
    2 实验方法
        2.1 表达载体pRI101AN-NfCCD7的构建
        2.2 冻融法转化农杆菌
        2.3 农杆菌浸染拟南芥
    3 结果与分析
        3.1 NfCCD7目的片段的扩增
        3.2 载体的构建
        3.3 拟南芥转基因植株的筛选
    4 讨论
结语
    1 结论
        1.1 从转录组数据库中筛选获得了目的Unigenes片段
        1.2 克隆得到了NfCCD7cDNA全长序列
        1.3 克隆所得基因编码的NfCCD7蛋白定位于细胞的叶绿体中
        1.4 获得了T₁代转基因拟南芥苗和种子
    2 展望
        2.1 遗传转化研究
        2.2 NfCCD7的时空表达
        2.3 NfCCD7的蛋白功能研究
参考文献
附录
    附录1：Prime Script^TMⅡ1^st Stand cDNA Synthesis Kit说明书
    附录2：DNA纯化回收试剂盒说明书
    附录3：pLB零背景快速克隆试剂盒说明书
    附录4：SMARTer?RACE5’/3’Kit说明书
    附录5：ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit说明书
    附录6：StarPure柱式超纯质粒大提试剂盒说明书
    附录7：植物表达载体pRI101AN-DNA图谱信息
    附录8：Phire Plant Direct PCR Master Mix试剂盒说明书
    附录9：英文缩略语
硕士期间发表的论文
致谢
统计学审核证明



本文编号：3820798