新型肝素酶高产菌的筛选鉴定及其基因的克隆与表达

发布时间：2023-05-28 12:00

　　肝素是一类高度硫酸化的线性糖胺聚糖,具有抗凝血、抗血栓、抗病毒、抗炎症及抗肿瘤等作用,但研究表明,在肝素应用的过程中常伴随着很多不同的副作用,例如肝素诱导性血小板减少、过敏反应等。相对来说,由普通肝素通过裂解得到的相对分子量较低的低分子量肝素和超低分子量肝素不仅具有更高的抗凝血活性,并且副作用更小,因此其研究与制备受到越来越多的关注。目前来说,低分子量肝素类产品主要是通过化学方法制备,该法处理效果过于激烈容易导致肝素结构发生改变,失去生物活性。相比之下,肝素酶裂解法反应条件温和,不影响肝素本身的结构特征,产物得率较高;反应一步完成,且几乎不产生杂质,比较利于下游的分离纯化。因此,肝素类药物的酶法生产研究具有重要的工业化应用前景。肝素酶是一类能够专一性地裂解肝素和硫酸类肝素糖苷键的蛋白质。肝素酶裂解法生产肝素类药物需要解决的关键问题是肝素酶来源狭隘以及酶制备成本高。因此,筛选高产肝素酶的新型微生物以及构建高效表达可溶性肝素酶体系就显得尤为重要。本课题正是基于以上问题,从自然界土壤中分离出产肝素酶的新型微生物——拉乌尔菌Raoultella sp.NX-TZ-3-15并对其发酵条件进行优化...

【文章页数】：93 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 肝素
        1.1.1 肝素的定义和结构
        1.1.2 肝素的作用
        1.1.3 肝素的副作用
    1.2 低分子量肝素和超低分子量肝素
        1.2.1 低分子量肝素和超低分子量肝素的定义
        1.2.2 低分子量肝素的制备方法
        1.2.3 低分子量肝素和超低分子量肝素的质量评价方法
        1.2.4 国内外研究现状和发展趋势
    1.3 肝素酶
        1.3.1 肝素酶的来源及分类
        1.3.2 肝素酶的作用机理
        1.3.3 肝素酶活性的检测方法
        1.3.4 肝素酶的应用
        1.3.5 微生物产肝素酶的国内外研究进展
    1.4 当前肝素酶法制备肝素类药物的瓶颈
    1.5 本论文的研究意义和主要内容
        1.5.1 研究意义
        1.5.2 研究内容
第2章 新型肝素酶高产菌的筛选与鉴定
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 样品来源
        2.2.2 实验试剂与仪器
        2.2.3 培养基
        2.2.4 肝素酶活的测定
        2.2.5 肝素酶高产菌的筛选
        2.2.6 肝素酶高产菌的菌种鉴定
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 肝素酶高产菌的筛选
        2.3.2 肝素酶高产菌的菌种鉴定
    2.4 小结
第3章 发酵条件对Raoultella sp.NX-TZ-3-15 产肝素酶的影响
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 菌种
        3.2.2 实验试剂与仪器
        3.2.3 培养基
        3.2.4 培养方法
        3.2.5 肝素酶活的测定
        3.2.6 培养基成分的优化
        3.2.7 培养环境条件的优化
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 培养基成分对Raoultella sp.NX-TZ-3-15 产肝素酶酶活的影响
        3.3.2 培养条件对Raoultella sp.NX-TZ-3-15 产肝素酶酶活的影响
        3.3.3 正交实验
    3.4 小结
第4章 Raoultella sp.NX-TZ-3-15 中肝素酶基因的克隆与表达
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验菌株和质粒
        4.2.2 实验试剂和实验仪器
        4.2.3 培养基
        4.2.4 Raoultella sp.NX-TZ-3-15 产肝素酶基因的确定
        4.2.5 无缝克隆与组装
        4.2.6 重组工程菌的验证
        4.2.7 重组工程菌的诱导表达
        4.2.8 重组工程菌表达产物SDS-PAGE分析
        4.2.9 肝素酶活的测定
        4.2.10 E.coli BLR(DE3)pBENT-H1 重组工程菌的诱导表达条件优化
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 重组质粒的构建
        4.3.2 重组工程菌的验证
        4.3.3 重组质粒测序结果
        4.3.4 重组工程菌诱导表达结果
        4.3.5 E.coli BLR(DE3)pBENT-H1 重组工程菌诱导条件的优化结果
    4.4 本章小结
第5章 结论与展望
    5.1 主要结论
    5.2 课题展望
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间的研究成果



本文编号：3824551