基于CRISPR技术的毕赤酵母多基因一步整合方法
发布时间：2023-06-01 05:26
毕赤酵母因其在蛋白表达方面的明显优势,被广泛用于工业生产和实验室研究。近年来,随着合成生物学的发展,已有多种药用化合物或中间体在毕赤酵母中成功合成(如6-甲基水杨酸、土曲霉酸、洛伐他汀等),证明了以毕赤酵母为底盘细胞进行异源多酶途径组装从而合成目标分子的应用潜力。由于游离质粒在毕赤酵母中不能稳定存在,外源基因大多只能通过整合到基因组的方式进行表达。但毕赤酵母同源重组效率低,且筛选标记较少,在复杂遗传线路设计和多酶途径组装时存在设计难度大、构建周期长等问题,限制了毕赤酵母的研究和应用。Vogl课题组通过大量实验探索,在毕赤酵母CBS7435菌株中建立了 CRISPR/Cas9基因编辑技术,实现了目标基因的敲除和突变,并开发了一种筛选标记循环回收使用的方法。此外,一些其他的筛选标记回收方法或多表达盒装载质粒构建方法在毕赤酵母中得以开发应用。但是,在组装复杂生物合成途径时,菌株构建周期长、设计难度大等问题仍难以解决。本文针对该问题开发了一套高效、无筛选标记的多基因一步整合方法,为毕赤酵母的基因敲入及重组表达菌株设计提供了新的方法和思路。首先,同源重组在DNA修复的竞争中处于劣势,Cas9产生...
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 毕赤酵母表达系统
1.1.1 毕赤酵母表达系统的发展
1.1.2 毕赤酵母表达系统的应用
1.1.3 毕赤酵母表达系统的主要问题
1.2 CRISPR/Cas9系统
1.2.1 CRISPR技术研究历史
1.2.2 CRISPR/Cas9系统的组成与作用机制
1.2.3 CRISPR/Cas9系统的改造
1.2.4 CRISPR技术在毕赤酵母中的应用
1.3 本课题的研究背景、目的及意义
第2章 毕赤酵母CRISPR/CAS9基因编辑方法的初步建立
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 菌株和质粒
2.2.2 分子生物学试剂和试剂盒
2.2.3 培养基和培养方法
2.2.4 试剂和缓冲溶液
2.2.5 本章引物及PCR反应
2.2.6 DNA片段纯化及回收
2.2.7 Overlap PCR
2.2.8 基因无缝克隆
2.2.9 大肠杆菌感受态制备及转化
2.2.10 毕赤酵母感受态制备及转化
2.2.11 酵母基因组的提取
2.2.12 敲除菌株的PCR验证
2.3 结果与讨论
2.3.1 gRNA-Cas9系列载体构建
2.3.2 供体DNA系列质粒构建
2.3.3 毕赤酵母GS115中CRISPR/Cas9基因编辑效果分析
2.3.4 非同源末端修复机制功能缺陷株Δku70的构建与分析
2.3.5 菌株Δku70中的CRISPR/Cas9的基因编辑效果分析
2.3.6 本章小结
第3章 用于CRISPR/CAS9基因编辑的同源重组整合位点筛选与验证
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.3 结果与讨论
3.3.1 整合位点的选择与gRNA靶点的设计
3.3.2 gRNA-Cas9系列质粒构建
3.3.3 供体DNA质粒构建
3.3.4 不同位点的同源重组效率分析
3.3.5 组氨酸添加对同源重组效率的影响
3.3.6 本章小结
第4章 基于CRISPR/CAS9的毕赤酵母多位点一步整合法的建立与检验
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.3 结果与讨论
4.3.1 多RGR体系质粒构建
4.3.2 供体DNA质粒构建
4.3.3 双位点整合效率分析
4.3.4 三位点整合效率分析
4.3.5 本章小结
第5章 基于CRISPR/CAS9的毕赤酵母多基因一步整合法的应用检验
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 菌株和质粒
5.2.2 摇瓶培养合成产物
5.2.3 产物萃取与分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 供体DNA质粒构建
5.3.2 双片段同时整合的酵母菌株筛选
5.3.3 重组菌株K-NX表达产物分析
5.3.4 三片段同时整合的酵母菌株筛选
5.3.5 重组菌株K-NXA表达产物分析
5.3.6 本章小结
第6章 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间撰写的论文
附录1 实验中所用的质粒及菌株
附录2 合成基因序列
本文编号：3826707
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 毕赤酵母表达系统
1.1.1 毕赤酵母表达系统的发展
1.1.2 毕赤酵母表达系统的应用
1.1.3 毕赤酵母表达系统的主要问题
1.2 CRISPR/Cas9系统
1.2.1 CRISPR技术研究历史
1.2.2 CRISPR/Cas9系统的组成与作用机制
1.2.3 CRISPR/Cas9系统的改造
1.2.4 CRISPR技术在毕赤酵母中的应用
1.3 本课题的研究背景、目的及意义
第2章 毕赤酵母CRISPR/CAS9基因编辑方法的初步建立
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 菌株和质粒
2.2.2 分子生物学试剂和试剂盒
2.2.3 培养基和培养方法
2.2.4 试剂和缓冲溶液
2.2.5 本章引物及PCR反应
2.2.6 DNA片段纯化及回收
2.2.7 Overlap PCR
2.2.8 基因无缝克隆
2.2.9 大肠杆菌感受态制备及转化
2.2.10 毕赤酵母感受态制备及转化
2.2.11 酵母基因组的提取
2.2.12 敲除菌株的PCR验证
2.3 结果与讨论
2.3.1 gRNA-Cas9系列载体构建
2.3.2 供体DNA系列质粒构建
2.3.3 毕赤酵母GS115中CRISPR/Cas9基因编辑效果分析
2.3.4 非同源末端修复机制功能缺陷株Δku70的构建与分析
2.3.5 菌株Δku70中的CRISPR/Cas9的基因编辑效果分析
2.3.6 本章小结
第3章 用于CRISPR/CAS9基因编辑的同源重组整合位点筛选与验证
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.3 结果与讨论
3.3.1 整合位点的选择与gRNA靶点的设计
3.3.2 gRNA-Cas9系列质粒构建
3.3.3 供体DNA质粒构建
3.3.4 不同位点的同源重组效率分析
3.3.5 组氨酸添加对同源重组效率的影响
3.3.6 本章小结
第4章 基于CRISPR/CAS9的毕赤酵母多位点一步整合法的建立与检验
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.3 结果与讨论
4.3.1 多RGR体系质粒构建
4.3.2 供体DNA质粒构建
4.3.3 双位点整合效率分析
4.3.4 三位点整合效率分析
4.3.5 本章小结
第5章 基于CRISPR/CAS9的毕赤酵母多基因一步整合法的应用检验
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 菌株和质粒
5.2.2 摇瓶培养合成产物
5.2.3 产物萃取与分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 供体DNA质粒构建
5.3.2 双片段同时整合的酵母菌株筛选
5.3.3 重组菌株K-NX表达产物分析
5.3.4 三片段同时整合的酵母菌株筛选
5.3.5 重组菌株K-NXA表达产物分析
5.3.6 本章小结
第6章 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间撰写的论文
附录1 实验中所用的质粒及菌株
附录2 合成基因序列
本文编号：3826707
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3826707.html
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