番茄DNA甲基转移酶SlDRM2L基因的克隆及表达分析
发布时间：2023-08-01 19:07
植物体作为固着物在生长发育期间会受到诸多非生物胁迫因素的影响。随着工业化的发展,大量温室气体排放导致环境温度在不断提高。这些使大量植物不得不通过改变自身遗传调节机制来提高对恶劣环境的耐受性,以此增加存活率。而植物提高自身在胁迫环境下耐受力的主要方式是通过DNA甲基化等表观遗传手段。DNA甲基化主要是在甲基转移酶的催化下修饰基因组DNA来响应外界环境的胁迫,其中参与植物中DNA甲基化起始的主要DNA甲基转移酶是DRM2。DRM2在植物耐受性方面的研究较为全面,比如拟南芥DRM2在盐胁迫耐受性的研究中,结果表明DNA甲基转移酶可能间接促进纤维素合成酶的表达进而调控纤维素合成的水平,最终赋予拟南芥盐胁迫的耐受性。在茶树也有类似的发现,通过改变Cs DRM2基因的表达水平使得基因组甲基化发生变化,以此参与茶树对低温胁迫的响应。本研究通过NCBI数据库,在番茄(Solanum lycopersicum)中发现了一个与拟南芥胞嘧啶甲基转移酶DRM2同源性较高的序列,即SlDRM2L。通过Gen Bank(登录号NM＿001246974)获得番茄DNA甲基转移酶SlDRM2L基因的c DNA全长序列...
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 番茄生物学地位
1.2 表观遗传学
1.2.1 动物表观遗传学
1.2.2 植物表观遗传学
1.3 DNA甲基化
1.3.1 DNA甲基化
1.3.2 植物的DNA甲基化
1.3.3 域重排甲基转移酶(DRM)
1.4 非生物因素胁迫
1.4.1 非生物因素
1.4.2 高温热胁迫
1.5 泛素结合结构域
1.5.1 UBA结构域
1.6 转基因技术
1.6.1 转基因
1.6.2 农杆菌介导转化
1.7 课题研究的目的及意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体及菌株材料
2.1.3 引物设计序列
2.1.4 常用生化试剂
2.2 培养基配置
2.2.1 载体构建相关实验培养基
2.2.2 番茄转基因技术相关培养基及生化试剂配置
2.2.3 烟草瞬时表达诱导液
2.3 实验室仪器、设备
2.4 实验方法
2.4.1 Trizol法提取野生型番茄RNA
2.4.2 反转录获cDNA
2.5 载体构建
2.5.1 设计引物
2.5.2 稀释引物
2.5.3 目的基因获得
2.5.4 琼脂糖凝胶电泳
2.5.5 PCR产物纯化
2.5.6 双酶切反应
2.5.7 连接反应
2.5.8 制备大肠杆菌感受态
2.5.9 大肠杆菌DH5a转化
2.5.10 阳性菌鉴定
2.5.11 质粒DNA提取
2.5.12 测序及分析
2.5.13 农杆菌感受态制备
2.5.14 农杆菌转化
2.5.15 阳性农杆菌的储存
2.6 基因沉默载体构建
2.7 SlDRM2L基因亚细胞定位分析
2.7.1 融合表达载体构建
2.7.2 烟草瞬时表达
2.7.2.1 注射诱导液制备
2.7.2.2 激光共聚焦显微镜观察
2.8 SlDRM2L基因在不同组织的表达情况
2.8.1 反转录cDNA
2.8.2 荧光定量PCR
2.9 植物转基因实验
2.9.1 番茄组织培养
2.9.2 农杆菌介导的遗传转化技术
2.9.3 抗生素筛选及生根
2.9.4 炼苗培养
2.9.5 阳性植株鉴定
2.9.5.1 使用CTAB法提取叶片的DNA
2.9.5.2 RNA水平阳性植株的鉴定
2.9.6 转基因阳性苗移栽培养
2.9.7 收集番茄果实
2.9.8 CTAB法提取果实DNA
2.9.9 亚硫酸氢钠测序法分析DNA甲基化水平
2.10 高温下SlDRM2L基因的表达水平
2.11 检测高温响应基因半定量
第三章 实验结果与分析
3.1 生物信息学分析
3.1.1 番茄SlDRM2L基因
3.1.2 番茄SlDRM2L结构域分析
3.1.3 番茄SlDRM2L蛋白质理化分析
3.1.4 进化树分析
3.2 SlDRM2L蛋白亚细胞定位分析
3.2.1 构建融合表达载体
3.3 SlDRM2L基因表达模式分析
3.4 番茄SlDRM2L受高温诱导分析
3.5 番茄cDNA及目的基因的获得
3.5.1 目的基因获取
3.5.2 特异性基因片段的获取
3.5.3 pSK-SiRNA1 阳性鉴定
3.5.4 pSK-SiRNA1-SiRNA2 阳性鉴定
3.5.5 基因沉默表达载体鉴定
3.5.6 农杆菌阳性鉴定
3.6 转基因番茄制备
3.6.1 番茄组织培养
3.6.2 番茄组织培养
3.6.3 农杆菌介导侵染
3.6.4 卡纳霉素(Kana)梯度筛选与愈伤分化
3.6.5 生根培养
3.6.6 炼苗
3.6.7 DNA及转录水平阳性鉴定
3.6.8 果实重量及大小比较
3.6.9 MuDR转座子启动子区域甲基化水平检测
3.7 参与高温响应基因鉴定分析
第四章 结论与讨论
4.1 结论
4.2 讨论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间发表论文及参与项目
本文编号：3838187
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 番茄生物学地位
1.2 表观遗传学
1.2.1 动物表观遗传学
1.2.2 植物表观遗传学
1.3 DNA甲基化
1.3.1 DNA甲基化
1.3.2 植物的DNA甲基化
1.3.3 域重排甲基转移酶(DRM)
1.4 非生物因素胁迫
1.4.1 非生物因素
1.4.2 高温热胁迫
1.5 泛素结合结构域
1.5.1 UBA结构域
1.6 转基因技术
1.6.1 转基因
1.6.2 农杆菌介导转化
1.7 课题研究的目的及意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 载体及菌株材料
2.1.3 引物设计序列
2.1.4 常用生化试剂
2.2 培养基配置
2.2.1 载体构建相关实验培养基
2.2.2 番茄转基因技术相关培养基及生化试剂配置
2.2.3 烟草瞬时表达诱导液
2.3 实验室仪器、设备
2.4 实验方法
2.4.1 Trizol法提取野生型番茄RNA
2.4.2 反转录获cDNA
2.5 载体构建
2.5.1 设计引物
2.5.2 稀释引物
2.5.3 目的基因获得
2.5.4 琼脂糖凝胶电泳
2.5.5 PCR产物纯化
2.5.6 双酶切反应
2.5.7 连接反应
2.5.8 制备大肠杆菌感受态
2.5.9 大肠杆菌DH5a转化
2.5.10 阳性菌鉴定
2.5.11 质粒DNA提取
2.5.12 测序及分析
2.5.13 农杆菌感受态制备
2.5.14 农杆菌转化
2.5.15 阳性农杆菌的储存
2.6 基因沉默载体构建
2.7 SlDRM2L基因亚细胞定位分析
2.7.1 融合表达载体构建
2.7.2 烟草瞬时表达
2.7.2.1 注射诱导液制备
2.7.2.2 激光共聚焦显微镜观察
2.8 SlDRM2L基因在不同组织的表达情况
2.8.1 反转录cDNA
2.8.2 荧光定量PCR
2.9 植物转基因实验
2.9.1 番茄组织培养
2.9.2 农杆菌介导的遗传转化技术
2.9.3 抗生素筛选及生根
2.9.4 炼苗培养
2.9.5 阳性植株鉴定
2.9.5.1 使用CTAB法提取叶片的DNA
2.9.5.2 RNA水平阳性植株的鉴定
2.9.6 转基因阳性苗移栽培养
2.9.7 收集番茄果实
2.9.8 CTAB法提取果实DNA
2.9.9 亚硫酸氢钠测序法分析DNA甲基化水平
2.10 高温下SlDRM2L基因的表达水平
2.11 检测高温响应基因半定量
第三章 实验结果与分析
3.1 生物信息学分析
3.1.1 番茄SlDRM2L基因
3.1.2 番茄SlDRM2L结构域分析
3.1.3 番茄SlDRM2L蛋白质理化分析
3.1.4 进化树分析
3.2 SlDRM2L蛋白亚细胞定位分析
3.2.1 构建融合表达载体
3.3 SlDRM2L基因表达模式分析
3.4 番茄SlDRM2L受高温诱导分析
3.5 番茄cDNA及目的基因的获得
3.5.1 目的基因获取
3.5.2 特异性基因片段的获取
3.5.3 pSK-SiRNA1 阳性鉴定
3.5.4 pSK-SiRNA1-SiRNA2 阳性鉴定
3.5.5 基因沉默表达载体鉴定
3.5.6 农杆菌阳性鉴定
3.6 转基因番茄制备
3.6.1 番茄组织培养
3.6.2 番茄组织培养
3.6.3 农杆菌介导侵染
3.6.4 卡纳霉素(Kana)梯度筛选与愈伤分化
3.6.5 生根培养
3.6.6 炼苗
3.6.7 DNA及转录水平阳性鉴定
3.6.8 果实重量及大小比较
3.6.9 MuDR转座子启动子区域甲基化水平检测
3.7 参与高温响应基因鉴定分析
第四章 结论与讨论
4.1 结论
4.2 讨论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间发表论文及参与项目
本文编号：3838187
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3838187.html
最近更新
教材专著
