毛竹PhSUT4基因的功能研究

发布时间：2023-08-03 19:32

　　蔗糖作为光合作用的最初产物,主要通过蔗糖转运蛋白(Sugar transporter protein,SUT)运输至不同组织器官,满足植物生长发育需要。竹类植物生长迅速,意味着大量光合同化产物从母株到笋的快速运转。虽然SUT基因已经在不同物种中得到鉴定,但竹中尚未见SUT基因功能研究的报道。因此,本研究通过RT-PCR分离并克隆得到了一个毛竹SUT基因,通过生物信息学分析、组织表达模式分析、亚细胞定位以及启动子分析,并结合转基因功能验证等实验,探讨毛竹SUT在糖转运、光合作用和次生生长中的功能,为今后利用基因工程技术改良竹品质奠定了基础。主要研究结果如下:(1)毛竹PhSUT4基因的克隆及组织表达分析。本研究成功克隆1个毛竹蔗糖转运蛋白基因,全长1791bp,编码596个氨基酸,属于SUT2类群;进化树显示其与水稻OsSUT4聚为一簇,氨基酸序列对比分析也发现其与水稻OsSUT4序列相似性较高,故命名为PhSUT4基因。PhSUT4蛋白具有10个结构保守的跨膜结构域和4个磷酸化丝氨酸位点。荧光定量分析(qRT-PCR)其组织表达模式,结果表明,毛竹PhSUT4基因主要在维管丰富的部位(...

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【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 研究目的与意义
    1.2 蔗糖转运体SUTs家族研究进展
        1.2.1 SUTs基因的发现
        1.2.2 SUTs基因的进化
        1.2.3 SUTs的结构
        1.2.4 SUTs具有装载、运输和卸载的功能
        1.2.5 糖的运输与光合作用
        1.2.6 糖的运输与纤维素合成
    1.3 研究的主要内容与技术路线
        1.3.1 研究的主要内容
        1.3.2 技术路线
第二章 毛竹PhSUT4 基因的克隆及表达分析
    2.1 试验材料
    2.2 试验方法
        2.2.1 毛竹PhSUT4 基因的克隆
            2.2.1.1 毛竹叶总RNA的提取
            2.2.1.2 cDNA的合成
            2.2.1.3 毛竹PhSUT4 基因全长克隆
        2.2.2 毛竹PhSUT4 基因的生物信息学分析
            2.2.2.1 高等植物中SUTs蛋白序列进化树的构建
            2.2.2.2 毛竹PhSUT4 蛋白保守型结构域分析
            2.2.2.3 毛竹PhSUT4 基因基本理化性质及二级结构分析
            2.2.2.4 毛竹PhSUT4 基因跨膜结构域分析
            2.2.2.5 毛竹PhSUT4 基因的三级结构预测
            2.2.2.6 毛竹PhSUT4 基因磷酸化位点预测
            2.2.2.7 毛竹PhSUT4 基因多重序列比对分析
        2.2.3 毛竹PhSUT4 基因的组织表达分析
            2.2.3.1 组成型组织表达
            2.2.3.2 诱导型组织表达
        2.2.4 毛竹PhSUT4 基因的亚细胞定位分析
            2.2.4.1 构建亚细胞定位表达载体
            2.2.4.2 毛竹PhSUT4 基因亚细胞定位扩增序列和Part27 载体质粒双酶切
            2.2.4.3 酶切产物纯化回收
            2.2.4.4 毛竹PhSUT4与Part27 表达载体的连接
            2.2.4.5 毛竹 Ph SUT4-Part27 质粒双酶切验证
            2.2.4.6 基因枪轰击法转化洋葱表皮细胞
    2.3 结果与分析
        2.3.1 毛竹叶总RNA提取
        2.3.2 毛竹Ph SUT4 基因PCR扩增
        2.3.3 毛竹PhSUT4 基因的大肠杆菌-菌液PCR
        2.3.4 生物信息学分析
            2.3.4.1 高等植物中SUTs蛋白序列系统进化树的构建
            2.3.4.2 毛竹PhSUT4 蛋白保守结构域分析
            2.3.4.3 毛竹PhSUT4 基因基本理化性质及二级结构分析
            2.3.4.4 毛竹PhSUT4 蛋白质跨膜结构域分析
            2.3.4.5 毛竹PhSUT4 蛋白质的三级结构预测
            2.3.4.6 毛竹PhSUT4 蛋白质磷酸化位点预测
            2.3.4.7 毛竹PhSUT4 氨基酸多重序列比对分析
        2.3.5 组织表达分析
            2.3.5.1 毛竹PhSUT4 基因组织表达模式分析
            2.3.5.2 毛竹PhSUT4 基因光响应表达分析
            2.3.5.3 环境胁迫下毛竹Ph SUT4 基因的表达分析
        2.3.6 亚细胞定位分析
            2.3.6.1 亚细胞定位PCR扩增
            2.3.6.2 毛竹PhSUT4-Part27 质粒PCR及质粒双酶切
            2.3.6.3 亚细胞定位分析
    2.4 讨论
第三章 毛竹PhpSUT4 启动子的克隆及表达部位分析
    3.1 试验材料
    3.2 试验方法
        3.2.1 毛竹PhpSUT4 启动子的克隆
            3.2.1.1 引物设计
            3.2.1.2 启动子序列PCR扩增
            3.2.1.3 PCR回收产物和T载体连接
            3.2.1.4 转化大肠杆菌
            3.2.1.5 大肠杆菌-菌液PCR和质粒提取
            3.2.1.6 启动子质粒测序
        3.2.2 启动子生物信息学分析
            3.2.2.1 毛竹PhpSUT4 启动子元件分析
        3.2.3 融合质粒PhpSUT4：GUS的构建
            3.2.3.1 启动子融合pBI-MCS
            3.2.3.2 毛竹Ph pSUT4-pBI-MCS基因转化DH5α大肠杆菌感受态
            3.2.3.3 启动子PhpSUT4-pBI-MCS大肠杆菌-菌液PCR
            3.2.3.4 扩大培养并提取质粒
        3.2.4 启动子PhpSUT4-pBI-MCS遗传转化烟草叶片
            3.2.4.1 启动子PhpSUT4-pBI-MCS质粒转化EHA105 农杆菌感受态细胞
            3.2.4.2 启动子PhpSUT4-pBI-MCS农杆菌-菌液PCR并扩大培养
            3.2.4.3 启动子PhpSUT4-pBI-MCS的农杆菌遗传转化烟草叶片
            3.2.4.4 pSUT4 启动子阳性植株的鉴定
        3.2.5 转基因烟草的GUS染色分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 毛竹PhpSUT4 启动子的克隆
        3.3.2 毛竹PhpSUT4 启动子生物信息学分析
        3.3.3 毛竹PhpSUT4-pMD19T及 PhpSUT4-pBI-MCS质粒双酶切
        3.3.4 pSUT4-pMD19T及 p SUT4-pBI-MCS大肠杆菌-菌液PCR
        3.3.5 毛竹PhpSUT4-pBI-MCS遗传转化小麦愈伤和GUS活性鉴定
        3.3.6 毛竹PhpSUT4 遗传转化烟草与启动子表达部位分析
    3.4 讨论
第四章 毛竹PhSUT4 基因在烟草生长发育中的作用
    4.1 试验材料
    4.2 试验方法
        4.2.1 构建过表达载体
        4.2.2 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N叶盘法转化烟草
        4.2.3 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N转基因烟草植株阳性鉴定
        4.2.4 转基因植株相关指标测定
            4.2.4.1 光合效率的测定
            4.2.4.2 转基因植株叶片叶绿素含量的测定
            4.2.4.3 转基因植株叶片及茎秆可溶性糖含量的测定
            4.2.4.4 转基因植株茎秆可溶性纤维素含量的测定
            4.2.4.5 转基因植株木质素含量的测定
            4.2.4.6 转基因植株茎秆显微观察
    4.3 结果与分析
        4.3.1 过表达载体的构建
        4.3.2 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N叶盘法遗传转化烟草
            4.3.2.1 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N农杆菌PCR
            4.3.2.2 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N烟草共培养、选择培养及生根培养
            4.3.2.3 毛竹PhSUT4-pCAMBIA1303N转基因烟草阳性鉴定
            4.3.2.4 PhSUT4-pCAMBIA1303N转基因烟草实时荧光定量分析
        4.3.3 功能分析
            4.3.3.1 PhSUT4 转基因烟草表型变化
            4.3.3.2 转基因植株的光合效率
            4.3.3.3 转基因植株叶绿素含量
            4.3.3.4 过表达Ph SUT4 基因对烟草可溶性糖、纤维素和木质素含量的影响
            4.3.3.5 转基因烟草茎秆显微观察
    4.4 讨论
第五章 毛竹PhSUT4 基因遗传转化三月竹
    5.1 试验材料
    5.2 试验方法
        5.2.1 毛竹PhSUT4 基因遗传转化三月竹
            5.2.1.1 三月竹未熟种子萌发
            5.2.1.2 基因枪及农杆菌协同诱导法遗传转化三月竹
        5.2.2 转基因三月竹阳性验证
        5.2.3 转基因三月竹PhSUT4 基因表达分析
        5.2.4 转基因三月竹光合效率分析
    5.3 结果与分析
        5.3.1 毛竹PhSUT4 遗传转化三月竹
        5.3.2 转基因三月竹阳性鉴定
        5.3.3 转基因三月竹PhSUT4 基因表达量分析
        5.3.4 转基因三月竹光合效率分析
    5.4 讨论
结论
致谢
参考文献
附录 研究所用引物序列、药品及培养基配方和载体图
攻读硕士期间发表的学术论文及研究成果



本文编号：3838679