致病疫霉菌侵染上调表达RXLR效应基因的初步分析及寄生疫霉菌效应基因PpE4的毒性功能研究

发布时间：2023-12-02 10:02

　　疫霉菌属于卵菌,被称为“植物毁灭者”。其中最臭名昭著的是引起马铃薯晚疫病的致病疫霉菌(Phytophthora infestans),它曾导致19世纪“爱尔兰大饥荒”,至今仍给现代马铃薯生产造成巨大经济损失。而寄生疫霉菌(P.parasitica),在系统发育上与致病疫霉菌关系较近,不仅引起烟草黑胫病,并且能够侵染范围非常广泛的植物。它们都是半活体营养型病原菌,在侵染早期需要抑制植物细胞坏死维持活体营养,后期通过诱导细胞坏死转入死体营养,因此对寄主植物细胞死亡的调控在侵染过程中尤为重要。RXLR效应蛋白是卵菌特有的一类分泌致病因子,能够进入植物细胞并发挥毒性功能。致病疫霉菌和寄生疫霉菌基因组中存在上百个RXLR效应基因,只有少数基因的功能得到部分解析。RXLR效应蛋白生物学功能的研究以及其宿主靶标的鉴定有助于揭示疫霉菌致病机理,挖掘未知抗病基因以及制定有效的病害防控策略。本研究利用农杆菌介导的瞬时表达技术对致病疫霉菌和寄生疫霉菌候选RXLR效应基因进行了初步分析,包括它们在植物中的亚细胞定位,激发细胞坏死或抑制细胞坏死的能力,以及对病原菌侵染的贡献;进一步利用实时定量PCR、PEG-C...

【文章页数】：133 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
    1.1 卵菌概述
        1.1.1 卵菌系统发育
        1.1.2 卵菌病害
    1.2 植物与卵菌互作的分子机制
        1.2.1 植物免疫系统
        1.2.2 胞内NLR受体的识别模式
        1.2.3 ETI和PTI下游信号
        1.2.4 卵菌的致病机理
    1.3 RXLR效应基因研究进展
        1.3.1 RXLR效应基因大量存在于疫霉菌基因组
        1.3.2 RXLR效应蛋白的分泌及转运
        1.3.3 RXLR效应蛋白的生物学功能研究策略
        1.3.4 RXLR效应蛋白抑制植物免疫
        1.3.5 RXLR效应蛋白的寄主靶标
    1.4 本研究的目的及意义
第二章 致病疫霉菌RXLR效应蛋白初步分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 候选RXLR效应基因的克隆及载体构建
        2.1.3 农杆菌介导的瞬时表达分析
        2.1.4 亚细胞定位观察
        2.1.5 蛋白免疫印迹
        2.1.6 寄生疫霉接菌分析
        2.1.7 植物培养及拟南芥转化
        2.1.8 RNA提取及半定量PCR
    2.2 结果与分析
        2.2.1 候选PiRXLR效应基因的分析及克隆
        2.2.2 候选PiRXLR效应基因在烟草中的瞬时表达分析
        2.2.3 候选PiRXLR效应蛋白在本氏烟草中的亚细胞定位分析
        2.2.4 致病疫霉菌和寄生疫霉菌Avrblb2同源基因的亚细胞定位
        2.2.5 Avrblb2同源基因激发烟草细胞坏死
        2.2.6 Avrblb2同源基因对植物生长表型以及感病性的影响
    2.3 讨论
        2.3.1 RXLR效应蛋白靶向不同亚细胞结构抑制植物免疫
        2.3.2 Avrblb2同源蛋白特异定位于植物细胞核
        2.3.3 Avrblb2同源基因激发植物细胞坏死
        2.3.4 Avrblb2同源基因对植物的影响
第三章 寄生疫霉菌RXLR效应基因PpE4功能分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 载体构建
        3.1.3 DNA、RNA提取及实时定量PCR
        3.1.4 农杆菌介导的瞬时表达
        3.1.5 病毒诱导的基因沉默
        3.1.6 植物培养及拟南芥转化
        3.1.7 寄生疫霉菌培养及转化子制备
        3.1.8 寄生疫霉菌接菌分析
        3.1.9 荧光显微镜观察
        3.1.10 蛋白免疫印迹
    3.2 结果与分析
        3.2.1 PpE4在寄生疫霉菌侵染早期高度上调表达
        3.2.2 PpE4的多态性分析
        3.2.3 PpE4激发细胞坏死的分析
        3.2.4 PpE4的分泌及转运
        3.2.5 植物中表达PpE4使植物更感病
        3.2.6 PpE4沉默减弱寄生疫霉菌的致病性
    3.3 讨论
        3.3.1 PpE4在侵染早期高度上调表达
        3.3.2 PpE4从吸器分泌并转运至植物细胞
        3.3.3 PpE4对病原菌毒性的贡献
        3.3.4 PpE4激发的细胞死亡与植物识别相关
        3.3.5 PpE4的缺失以及变异分析
第四章 与PiAvr3a共线性的寄生疫霉菌基因PpAvh3a的功能分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 载体构建
        4.1.3 RNA提取及实时定量PCR
        4.1.4 PpAvh3a-mCherry过表达转化子制备及分析
        4.1.5 荧光显微镜观察
        4.1.6 PpAvh3a的瞬时表达分析
        4.1.7 PpAvh3a转基因拟南芥的分析
        4.1.8 胼胝质沉积分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 PpAvh3a与致病疫霉菌Avr3a以及寄生霜霉ATR1共线性
        4.2.2 PpAvh3a与Avr3a和ATR1蛋白序列差异较大
        4.2.3 PpAvh3a在寄生疫霉菌中相对保守
        4.2.4 侵染过程中PpAvh3a在吸器特异积累
        4.2.5 PpAvh3a-mCherry过表达转化子致病力减弱
        4.2.6 PpAvh3a在烟草中不激发细胞坏死
        4.2.7 PpAvh3a不抑制PTI或ETI
        4.2.8 在植物中表达PpAvh3a不促进病原菌侵染
    4.3 讨论
第五章 结论与创新点
    5.1 结论
    5.2 创新点
参考文献
附录
    附录1 培养基及试剂配方
    附录2 候选RXLR效应基因引物
    附录3 RXLR效应基因构建情况以及亚细胞定位
    附录4 PpE4以及PpAvh3a相关引物及载体构建
致谢
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本文编号：3869436