水稻斑点叶突变体spl24基因克隆与功能验证

发布时间：2023-12-09 08:45

　　水稻斑点叶突变体spl24是利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)诱变水稻品种IR64所得来的一个褐色斑点的新型抗病的突变体,属于类病斑突变体,研究学者通常用该类突变体来研究植物PCD(Programmed cell death,PCD)以及植物的抗逆性。对spl24斑点叶突变体的研究包括表型特征、生理生化指标、抗病性、遗传特性、目的基因的克隆和功能分析、生物信息学分析、转录组测序等,通过这一系列的测定和分析了解斑点叶突变体的斑点发生机制以及其突变体的抗病机制,为斑点叶的突变体的研究提供理论参考,主要的研究包括以下几个方面:1、斑点叶突变体spl24表型:spl24斑点叶突变体在大田的自然条件下出现斑点的时间为抽穗初期,斑点是从叶尖部位开始出现逐渐蔓延,斑点较小形状圆或者椭圆均匀分布在整张叶片,从斑点出现开始叶子一直有斑点生长,到抽穗后期和灌浆期整个植株的所有叶片均成为褐色。在植株成熟以后进行田间农艺性状考察,spl24与野生型IR64相比,结实率和千粒重等上均存在极显著的降低,而spl24突变体在有效分蘖数、穗长、每穗实粒数和产量等性状也存在着降低的情况。2、斑点叶突变体spl24生理...

【文章页数】：118 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 斑点叶突变体的来源和分类
    1.2 斑点的表型特征
    1.3 斑点叶突变体的抗性鉴别和生理生化指标
    1.4 斑点叶突变体的细胞死亡分析
    1.5 斑点叶突变体的发生机制
        1.5.1 抗病基因突变或表达异常
        1.5.2 蛋白酶活性下降或者功能丧失
        1.5.3 转录因子功能异常
        1.5.4 代谢途径失调
        1.5.5 活性氧物质的积累
        1.5.6 激素的失调
        1.5.7 逆境胁迫
    1.6 斑点叶突变体的遗传特性、基因克隆和功能分析
    1.7 斑点叶突变体的研究意义
2 材料和方法
    2.1 农艺性状和生理生化指标检测
        2.1.1 突变体的农艺性状调查
        2.1.2 突变体斑点的光照诱导观察
        2.1.3 突变体光合作用指标检测
        2.1.4 突变体光合色素含量测定
        2.1.5 突变体可溶性蛋白含量测定
        2.1.6 spl24 突变体酶活测定和相关指标检测
        2.1.7 spl24 突变体程序性细胞死亡检测
        2.1.8 spl24 突变体抗性鉴定
    2.2 基因定位与候选基因克隆
        2.2.1 斑点叶突变体spl24 的遗传分析
        2.2.2 spl24 斑点叶基因的初定位
        2.2.3 spl24 斑点叶基因的精细定位
        2.2.4 候选基因的预测
    2.3 水稻斑点叶基因OsSPL24 定位与克隆与功能分析
        2.3.1 DNA和 RNA的提取
        2.3.2 qRT-PCR实验
        2.3.3 质粒的提取
        2.3.4 互补质粒构建
        2.3.5 RNAi质粒构建
        2.3.6 GUS质粒构建
        2.3.7 亚细胞质粒构建
        2.3.8 酵母双杂质粒构建
        2.3.9 土壤农杆菌EH105 电击转化实验方法
        2.3.10 原生质体提取和质粒转化方法
        2.3.11 GUS染色方法
        2.3.12 酵母双杂实验方法
        2.3.13 愈伤组织的诱导、杆菌转化和转基因植株再生
        2.3.14 TUNEL实验方法
    2.4 回交后代转录组测序分析
        2.4.1 转录组测序实验材料
        2.4.2 转录组测序
        2.4.3 转录组数据分析
        2.4.4 植物激素含量测定
3 结果和分析
    3.1 突变体农艺性状和生理生化分析
        3.1.1 突变体spl24 的表型特征
        3.1.2 光对斑点叶突变体的影响分析
        3.1.3 叶绿素含量和可溶性蛋白含量的分析
        3.1.4 斑点叶突变体spl24的ROS异常
        3.1.5 spl24 突变体程序性细胞死亡
        3.1.6 斑点叶突变体spl24 的抗性增强
    3.2 突变体spl24 遗传分析和基因定位
        3.2.1 突变体spl24 的遗传分析
        3.2.2 spl24 基因的定位
        3.2.3 候选基因的预测与测序验证
    3.3 OsSPL24 基因的克隆和功能验证
        3.3.1 互补实验
        3.3.2 RNAi实验
        3.3.3 OsSPL24 基因组成型表达
        3.3.4 OsSPL24 蛋白主要定位于内质网
        3.3.5 OsSPL24 互作蛋白的筛选
        3.3.6 OsSPL24 基因的生物信息学分析
    3.4 突变体spl24 与结果与分析IR64 回交后代转录组分析
        3.4.1 回交植株表型和测序结果
        3.4.2 回交群体存在程序性细胞死亡
        3.4.3 转录组测序质量评估
        3.4.4 差异基因分析
        3.4.5 GO富集
        3.4.6 KEGG通路分析
        3.4.7 参与抗病调控的DEGs
        3.4.8 转录组测序对OsSPL24 基因的表达量分析
4 结论与讨论
    4.1 斑点的产生影响了spl24 的农艺性状
    4.2 斑点的产生影响了spl24 的生化生理特性
    4.3 ROS活性氧清除系统平衡遭破坏
    4.4 spl24 突变体中存在细胞程序性死亡
    4.5 斑点叶突变体spl24 对白叶枯病菌抗性增强
    4.6 OsSPL24 为一个新的斑点叶基因
    4.7 OsSPL24 基因属于Lys M-RLKs基因家族
    4.8 OsSPL24 蛋白定位于内质网并且该基因属于组成型表达
    4.9 突变体spl24 互补和干涉具有斑点表型
    4.10 OsSPL24 基因可能具有累积效应
参考文献
附录
    附录Ⅰ:本研究中所用引物
    附录Ⅱ:本研究中所用的培养基
    附录Ⅲ:在读期间研究成果
致谢



本文编号：3871227