利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制水稻温敏不育系研究

发布时间：2024-02-18 17:20

　　两系杂交水稻在我国水稻生产中占有举足轻重的地位,为保障我国粮食安全发挥了重大作用。培育两系杂交水稻最关键的是选育性状优良的不育系。tms5是我国应用最广泛的温敏不育基因。本研究利用CRISPR/Cas9技术对TMS5进行定点编辑,获得了一系列TMS5基因功能缺失的突变体。主要研究结果如下:(1)成功构建pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA表达载体,并将其通过农杆菌介导法转化粳稻品种F197,获得57株组培苗,其中有36株为阳性转基因植株。(2)对T₀代阳性转基因植株TMS5的突变情况分析,结果表明,在36株阳性转基因植株中,有23株检测到TMS5发生突变,突变率为63.89%。TMS5的突变类型包括杂合突变和纯合突变,其中杂合突变有15株,纯合突变有8株,纯合突变率占到了34.78%。纯合突变主要是在PAM前第3和第4碱基之间有单碱基A、T和G的插入,分别占了62.5%、25%和12.5%,而单碱基C的插入没有检测到。(3)对T₁代纯合缺失突变体的不育起点温度和农艺性状进行调查分析,结果表明,28℃可能是tms5突变体花粉育性...

【文章页数】：48 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
第1章 前言
    1.1 水稻光温敏雄性不育系的研究进展
        1.1.1 水稻光温敏雄性不育系的发现
        1.1.2 影响水稻光温敏雄性不育的因素
    1.2 水稻光温敏不育基tms5 的研究进展
        1.2.1 水稻光温敏不育基因tms5 的定位与分子机理研究
    1.3 CRCRISPR/Ca S系统的研究进展
        1.3.1 基因编辑技术的原理
        1.3.2 CRCRISPR/Cas系统发现
        1.3.3 CRISPR/Cas系统的结构
        1.3.4 CRISPR/Cas系统的分类
        1.3.5 CRISPR/Cas系统的作用机理
        1.3.6 CRISPR-Cas9 系统在水稻中的应用
    1.4 CRISPR/Cas系统的技术创新
        1.4.1 CRISPR-Cpf1
        1.4.2 单碱基编辑
        1.4.3 DNA-free
        1.4.4 CRISPR/xCas9
    1.5 目的与意义
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 水稻材料
        2.1.2 载体与菌株类型
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要培养基
        2.1.5 常用抗生素及其他试剂配制
        2.1.6 主要引物
        2.1.7 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 靶位点设计
        2.2.2 引物退火形成双链
        2.2.3 CRISPR/Cas载体的构建
    2.3 水稻材料的遗传转化
        2.3.1 种子消毒
        2.3.2 接种
        2.3.3 农杆菌介导转化水稻愈伤
    2.4 转基因阳性植株的获得
        2.4.1 水稻叶片DNA提取(CTAB法)
        2.4.2 PCR检测阳性转基因植株
    2.5 测序检测靶位点
    2.6 T₁代无选择标记基因突变株的获得
    2.7 碘-碘化钾染色检测花粉育性
    2.8 主要农艺性状考查与分析
第3章 结果与分析
    3.1 靶位点设计
    3.2 CRISPR/Ca S9 表达载体的构建
    3.3 转基因植株的鉴定及突变位点测序分析
    3.4 T₁代无选择标记基因突变株的获得及突变株不育起点温度的鉴定
    3.5 T₁代植株农艺性状分析
第4章 小结与讨论
    4.1 CRISPR/Cas9 在植物体中的编辑效率、突变特点和遗传特性
    4.2 CRISPR/Cas9 在植物体中脱靶效应
    4.3 tms5 突变体的不育起点温度鉴定
    4.4 tms5 突变体农艺性状分析
    4.5 展望
参考文献
附录
致谢
作者简介



本文编号：3902253