转基因水稻筛查检测阳性质粒pUC18-RICE-screen的构建及分子评价

发布时间：2024-02-20 22:52

　　标准物质是转基因生物安全监管和检验检测工作中进行质量控制的关键。目前,国内用于转基因检测的阳性对照资源匮乏,主要为基体标准物质,难以满足转基因生物安全监管和检测工作的需要。质粒标准物质作为转基因检测标准物质新的发展方向,具有广泛的应用价值。本研究通过收集整理相关数据库信息,获得了国内外19种主要转基因水稻(Oryza sativa)品系的遗传信息,全面分析其外源基因表达框中调控元件/基因的组成情况及使用频率,并结合目前现有转基因检测技术标准,确定了以水稻内标基因磷脂酶D基因(phospholipase D gene, PLD)、蔗糖磷酸合酶基因(sucrose phosphate synthase gene, SPS)和靶标基因CaMV35S启动子(35S promoter from Cauliflower mosaicvirus, P_CaMV35S)、Ubiquitin启动子(ubiquitin promoter from maize, P_Ubiquitin)、CaMV35S终止子、NOS终止子(terminator of nopaline...

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图2选用的7个筛查元件对19个水稻转化体的覆盖示意图

将上述7个水稻筛查元件/基因(PCaMV35S,PUbiquitin,TNOS,TCaMV35S,Bar,HPT,Bt)和2个常用水稻内标准基因(SPS和PLD)的检测靶标序列按顺序拼接成一段集成序列，序列总长3791bp，委托生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成，并装载....

图3阳性质粒分子pUC18-RICE-screen整合DNA序列

各筛查元件/基因目的条带的清晰度随pUC18-RICE-screen阳性质粒浓度的递减而减弱，各筛查元件/基因在质粒浓度为1×102copies/μL及以上的样品中均能被扩增，可满足相应筛查元件/基因定性PCR检测的需求。此外，值得注意的是，受到pUC18-RICE-scr....

图4阳性质粒分子pUC18-RICE-screen的载体结构图

参考上述pUC18-RICE-screen质粒普通PCR检测的适宜质粒浓度分析结果，选用6个浓度(1×106、1×105,1×104,1×103,1×102,10copies/μL)的pUC18-RICE-screen质粒梯度稀释液为DNA模板，进行qRT-PCR检测。结....

图5阳性质粒分子pUC18-RICE-screen经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切后的电泳

随着质粒标准分子概念的提出，近年来有关质粒标准分子应用于转基因检测的研究也逐渐增多。就水稻而言，汪小福等(2013)利用重叠PCR技术将PCaMV35S和TNOS等目标片段克隆构建到载体pUC19中，获得了转基因水稻筛查的重组标准质粒pUC-RS。同年，李晓飞等(2013)成功构....

本文编号：3904639