靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建

发布时间：2024-02-22 01:16

　　目的:构建靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计并合成靶向PD-L1基因的5对sgRNA序列。为了进一步降低克隆背景和提高构建阳性率,在受体载体中引入毒性蛋白系统(Ccd)。构建p X459-Ccd B重组载体,将p X459-Ccd B载体进行BbsⅠ酶切,将sgRNA插入到p X459-Ccd B骨架载体中,转化到不含Ccd A基因的宿主菌Stbl3中。酶切不完全引起的背景载体将因毒性蛋白的作用杀死宿主菌。转化后挑取阳性克隆,进行PCR和测序验证。结果与结论:经PCR和测序验证,重组质粒p X459-PD-L1-sgRNA构建成功,为下一步体内外敲除PD-L1基因和深入研究其在肿瘤免疫逃逸中的功能奠定了基础。

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1主要试剂和菌株
    1.2靶向PD-L1基因的gRNA的设计和选择
    1.3引物合成
    1. 4 质粒p X459-Ccd B的构建
        1.4.1构建过程
        1.4.2 Ccd B基因的扩增
        1.4.3目的片段与载体片段的连接
        1.4.4 p X459-Ccd B的验证
    1.5载体pX 459-PD-L1-sgRNA的构建
2 结果
    2.1 pX 459-CcdB的酶切鉴定
    2.2 pX 459-PD-L1-sgRNA的PCR鉴定
    2.3 pX 459-PD-L1-sgRNA的测序
3 讨论



本文编号：3906175