产甘油假丝酵母CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建

发布时间：2024-02-27 02:56

　　产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是一株具有多重抗逆特性的工业二倍体酵母,是优良的底盘细胞。但C.glycerinogenes的二倍体基因组、无有性生殖、缺乏选择标记等限制了该菌的基因编辑效率。新一代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统因为其快速、高效和简便的优点,可轻松实现基因点突变、片段敲除或敲入等精确编辑,被广泛应用于动物、植物和微生物。本论文旨在将CRISPR-Cas9技术应用于C.glycerinogenes的基因编辑,并进行了技术优化和TRP1、URA3、ADE2等基因的编辑应用,有以下主要研究成果:(1)为构建CRISPR-Cas9系统,设计和组装了可以插入Cas9、sgRNA等CRISPR组件的酵母整合表达载体pMY;通过Western Blotting分析不同密码子优化的Cas9基因的表达情况,确定适用于C.glycerinogenes的CgCas9序列;通过靶向反筛基因TRP1敲除试验,比较了ScSNR52p、GDPp、GAPp三种不同的启动子在C.glycerinogenes中转录sgRNA的强度,结果表明只有GAP启动子配合HH和H...

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1-1CRISPR-Cas9系统及其衍生技术[24]

第一章绪论将转录激活因子与dCas9结合引起目标基因转录水平上调的方式，被称为CRISPR激活（CRISPRactivation，CRISPRa）。另有一些研究将某些调节蛋白或RNA适配子与dCas9蛋白或sgRNA融合，借助sgRNA的引导和dCas9....

图1-2用于Cas9表达和sgRNA转录的分子部件和特性

第一章绪论辑效率至为关键[49]。Weninger等人使用表达Cas9和转录sgRNA的不同启动子进行组合，尝试在P.pastoris中建立CRISPR-Cas9系统，但是在96种组合中只有6种组合可实现有效的基因编辑[41]。这意味着筛选适用于特定....

图2-1pMY质粒构建Fig.2-1TheconstructionoftheplasmidpMY

江南大学硕士学位论文pPIC9K质粒为模板，hrAOX1t_F和hrAOX1t_R为引物PCR扩增得到序列的插入片段AOX1t（约270bp），其5′端有20bp长度的序列与插的3′端MCS序列互补。pURGAP为模板，hrURA5_F和....

图2-2pMY-ScCas9和pMY-CgCas9质粒构建Fig.2-2TheconstructionofintegrativeexpressionvectorpMY-ScCas9andpMY-CgCas9

第二章材料与方法有一个SV40NLS。pUC57-Cas9质粒（由生工学院陈献忠教授馈赠，热带假丝酵母（CandidatR质粒，含针对假丝酵母密码子优化后的Cas9基因）为模板，CgCa9_R为引物，PCR扩增得到约4.2kb大小的CgCas9基因片....

本文编号：3912270