基于新一代测序技术的梅毒患者tprK基因多样性分析

发布时间：2024-03-03 14:16

　　背景:梅毒螺旋体的重复基因K(tprK)被认为在梅毒持续性感染过程中扮演重要的角色。早期对于tprK基因多样性的研究以兔传的菌株为研究对,很少关注梅毒患者体内的变化特点,且采用的是菌落克隆-Sanger测序。方法:收集28份厦门大学附属中山医院就医的一期和二期梅毒患者的皮损标本,采用新一代测序技术(NGS)探讨梅毒患者tprK基因的变化特点。结果:不论在一期或者二期梅毒患者体内,梅毒螺旋体tprK基因的七个可变区均存在不同序列的混合。在计算每个可变区内不同序列所占比例时,发现除了可以用先前的克隆-Sanger测序方法检测到的主要序列之外,这28份标本中的梅毒螺旋体tprK基因可变区均都含有许多次要变体,并且这些变体相对频率主要集中1-5%之间。与一期梅毒患者体内的tprK基因可变区多样性比较,二期梅毒患者体中tprK基因其七个可变区发现了更多的混合性变体,并且可变区内主要序列的频率普遍降低(小于80%),同时伴随着分布在10-49.9%频率之间的次要变体比例增高。有趣的是,分析每个可变区内所获得的不同序列长度时,发现每个可变区内变体的序列长度变化仅相差3bp或为3bp的倍数。此外,在氨...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

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缩略词及中英文对照表
中文摘要
Abstract
第一章 绪论
    1. 梅毒的概述
    2. 抗原变异与梅毒的持续性感染
    3. tprK基因与梅毒螺旋体的免疫逃逸
    4. 研究目的与意义
第二章 实验材料与方法
    1. 实验材料
        1.1 收集临床梅毒患者的皮损标本
        1.2 实验主要试剂与耗材
        1.3 实验主要仪器
    2. 实验方法与步骤
        2.1 快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)
        2.2 梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)
        2.3 建立tp0574质粒标准品的qPCR标准曲线
        2.4 临床梅毒患者皮损组织悬液DNA提取与浓缩
        2.5 Roche LightCycler^? 480 qPCR检测临床样本中tp0574 DNA的拷贝数
        2.6 特异性扩增tprK基因全长
        2.7 分段二次扩增tprK基因
        2.8 分段扩增产物的二代测序文库构建
        2.9 tprK基因扩增产物的高通量测序
        2.10 基于克隆-Sanger的方法检测临床标本中梅毒螺旋体tprK基因多样性
第三章 实验结果
    1. tp0574质粒标准曲线建立
    2. qPCR检测临床患者皮损中tp0574 DNA的拷贝数
    3. tprK全长扩增及产物验证和纯化
    4. 分段二次扩增tprK基因及产物纯化
    5. 片段产物浓度及纯度检测结果
    6. 评估tprK基因扩增子测序质量
    7. 基于NGS检测临床样本中梅毒螺旋体tprK基因的多样性
        7.1 来源一期梅毒患者标本的tprK基因七个可变区变体的频率分布
        7.2 来源二期梅毒患者标本的tprK基因七个可变区变体的频率分布
        7.3 tprK基因的七个可变区不同序列的数量和长度变化
        7.4 tprK基因可变区的氨基酸序列
        7.5 tprK基因可变区的氨基酸序列共享性
    8. 基于克隆-Sanger检测临床样本中梅毒螺旋体tprK基因的多样性
        8.1 梅毒螺旋体tprK基因质粒构建
        8.2 菌落测序分析梅毒患者的tprK基因多样性
    9. 基于两种方法学检测临床样本中梅毒螺旋体tprK基因的多样性
第四章 讨论
    1. 一期梅毒患者中梅毒螺旋体tprK基因的多样性
    2. 比较一期与二期梅毒患者的tprK基因多样性
    3. tprK基因可变区的长度变化特点
    4. tprK基因可变区内氨基酸序列的特点
    5. 基于克隆-Sanger方法检测tprK基因存在的不足
    6. 不足与展望
第五章 结论
参考文献
致谢
攻读硕士期间的研究成果



本文编号：3917909