MAT2B基因在人类恶性黑色素瘤中的表达及其功能和分子机制研究

发布时间：2024-03-13 06:24

　　目的:恶性黑色素瘤是起源于人体组织中产生色素的黑素细胞的恶性肿瘤,这种疾病可以发生在许多不同部位,如皮肤、黏膜的表面、结膜以及葡萄膜等结构。恶性黑色素瘤,特别是晚期恶性黑色素瘤是一种侵袭性极强、致死性极高的恶性肿瘤。随着人们对黑色素瘤认识的深入,分子靶向治疗成为治疗恶性黑色素瘤的有效手段之一。在获得相对较好疗效的同时,耐药性的出现使得人们必须寻找新的,更可靠的肿瘤相关基因和治疗靶点。随着分子生物学,分子遗传学,基因功能组学,蛋白质组学以及二代测序技术的不断发展,如今发现并鉴定出新的肿瘤相关的致病基因变得更为可行和高效。本研究利用慢病毒介导的RNA干扰与芯片技术,探讨MAT2B基因在恶性黑色素瘤中的表达情况、如何影响恶性黑色素瘤细胞系的增殖和凋亡、裸鼠移植瘤的生长及其可能的下游效应分子机制。方法:本实验通过对GEO公共数据库中的基因表达谱数据进行分析,特别是对于包含有恶性黑色素瘤细胞系或恶性黑色素瘤肿瘤组织与正常皮肤组织或痣中具有表达差异的基因进行筛选。查阅相关文献与已报道的基因功能并根据相关预实验结果,选定候选的目的基因MAT2B,接着在5个恶性黑色素瘤细胞系、原发或转移的恶性黑色素瘤...

【文章页数】：121 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
英文缩略词对照表
中文摘要
Abstract
1.前言
2.实验材料
    2.1 细胞株
    2.2 黑色素瘤病理标本
    2.3 实验动物
    2.4 主要试剂
    2.5 主要仪器与设备
    2.6 主要溶液和试剂的配制
3.实验方法
    3.1 Real-time PCR检测MAT2B基因在5个恶性黑色素瘤细胞系中的表达情况
    3.2 免疫组化检测MAT2B基因在原发或转移性恶性黑色素瘤以及痣标本中的表达情况
        3.2.1 临床资料及病理标本的收集和石蜡切片的制作
        3.2.2 病理标本的HE染色
        3.2.3 病理标本的免疫组化染色
        3.2.4 免疫组化结果的判断
    3.3 慢病毒介导的MAT2B基因的RNA干扰
        3.3.1 MAT2B基因RNA干扰序列以及阴性对照序列的确定
        3.3.2 合成双链DNA oligo
        3.3.3 质粒载体的酶切及线性化
        3.3.4 重组质粒的构建和鉴定
        3.3.5 阳性菌的培养与质粒的抽提
        3.3.6 慢病毒的包装、纯化与滴度测定
        3.3.7 慢病毒感染人恶性黑色素瘤细胞系A375和Mel-RM .. 27
        3.3.8 Real-time PCR检测慢病毒感染恶性黑色素瘤细胞系后，MAT2B基因m RNA水平变化
        3.3.9 Western Blot检测慢病毒感染恶性黑色素瘤细胞系后，MAT2B蛋白水平变化
    3.4 Celigo全自动细胞计数分析仪检测MAT2B基因敲减后，A375细胞生长情况的变化
    3.5 MTT检测MAT2B基因敲减后黑色素瘤细胞的增殖情况
    3.6 MAT2B基因敲减后黑色素瘤细胞克隆形成能力检测
    3.7 流式细胞仪检测MAT2B基因敲减后恶性黑色素瘤细胞周期的变化
    3.8 MAT2B基因敲减后恶性黑色素瘤细胞凋亡的变化
    3.9 人恶性黑色素瘤细胞系A375裸鼠移植瘤模型的制作以及MAT2B基因敲减后裸鼠移植瘤生长情况
    3.10 表达谱芯片检测MAT2B敲减后差异表达的基因
    3.11 Real-time PCR和Western Blot对表达谱芯片检测结果进行验证
    3.12 统计检验方法
4.实验结果
    4.1 Real-time PCR检测MAT2B基因在5个人类恶性黑色素瘤细胞系中的表达情况
        4.1.1 PCR反应的扩增曲线
        4.1.2 PCR反应的溶解曲线
        4.1.3 实时荧光定量PCR检测
    4.2 免疫组化检测MAT2B基因在原发或转移性恶性黑色素瘤以及痣标本中的表达情况
        4.2.1 痣、原发或转移性黑色素瘤标本的HE染色
        4.2.2 痣、原发或转移性黑色素瘤标本的免疫组化染色
    4.3 慢病毒介导的MAT2B基因的RNA干扰
        4.3.1 MAT2B基因RNA干扰序列以及阴性对照序列的确定
        4.3.2 合成双链DNA oligo
        4.3.3 质粒载体的酶切及线性化
        4.3.4 重组质粒的构建和鉴定
        4.3.5 纯化后慢病毒滴度测定
        4.3.6 慢病毒感染人恶性黑色素瘤细胞系A375和Mel-RM
        4.3.7 Real-time PCR检测慢病毒感染后MAT2B基因m RNA水平变化
        4.3.8 Western Blot检测慢病毒感染后，MAT2B蛋白水平变化
    4.4 Celigo全自动细胞计数分析仪检测MAT2B基因敲减后细胞生长情况的变化
    4.5 MTT检测MAT2B基因敲减后恶性黑色素瘤细胞的增殖情况
    4.6 MAT2B基因敲减后恶性黑色素瘤细胞克隆形成能力检测
    4.7 流式细胞仪检测MAT2B基因敲减后恶性黑色素瘤细胞周期的变化
    4.8 MAT2B基因敲减后恶性黑色素瘤细胞凋亡的变化
    4.9 MAT2B基因敲减后裸鼠移植瘤的生长情况
    4.10 表达谱芯片检测MAT2B敲减后差异表达的基因
        4.10.1 RNA样品的质检结果
        4.10.2 表达谱芯片结果的IPA分析
    4.11 Real-time PCR和Western Blot对表达谱芯片检测结果进行验证
5.讨论
6.结论
7.参考文献
附录
致谢
课题综述
    参考文献



本文编号：3927328