山核桃贝壳杉烯氧化酶基因CcKO的克隆和表达分析

发布时间：2024-03-19 22:40

　　【目的】内根-贝壳杉烯氧化酶(KO)是赤霉素(GAs)生物合成途径关键酶,也是植物GAs生物合成抑制剂多效唑的靶酶,若GAs生物合成途径中在KO基因位点发生阻塞,会影响植株的正常生长。本研究克隆山核桃CcKO基因(Caca0733S0131)及其启动子并进行表达分析,以利于进一步探究山核桃CcKO基因在植物生长和发育过程中,尤其是与株高调控相关的生物学功能,从而助力山核桃优新种质的创制。【方法】以山核桃体细胞胚为试验材料,采用同源重组及PCR扩增技术,克隆获得山核桃KO的基因及启动子序列,并进一步构建了具有强启动子的35S∷CcKO∷GFP过表达载体和CcKOpro∷GUS启动子表达载体;利用BLAST在线工具得到该基因编码的氨基酸序列,并对其进行生物信息学分析和同源性分析;进一步通过农杆菌介导法将启动子表达载体及过表达载体转入核桃体细胞胚并进行植株再生试验,分别获得阳性再生植株,从而深入分析山核桃CcKO基因的生物学功能。【结果】通过克隆,获得1条山核桃CcKO开放阅读框,其全长为1 563 bp,共编码520个氨基酸,相对分子量为59.076 kDa。氨基酸同源性分析表明,山核桃C...

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【部分图文】：

图1CcKO的核苷酸序列及推导的氨基酸序列

BLAST比对发现山核桃CcKO基因属于细胞色素超家族P450系。山核桃CcKO基因编码的氨基酸序列与核桃JrKO氨基酸(NW＿017443530.1)同源性为96%，与欧洲栓皮栎(Quercussuber)KO(NW＿019812880.1)的同源性为79%，与板栗(....

图2不同物种KO氨基酸序列同源性比较

将克隆的山核桃CcKO基因推导的氨基酸序列与GenBank中已报道的其他物种的KO氨基酸序列进行同源性比对(图2)，结果表明，山核桃CcKO具有真核生物CYP450的氧化还原位点PERF、底物结合域ETLR，以及距离羧基端52—61位氨基酸的血红素结合域FGGGKRVCAG....

图3核桃CcKOpro∷GUS阳性体胚及再生植株的GUS定位分析

选取生长健壮的核桃体胚进行遗传转化(该体胚记为E0代体胚，E0表面产生的新体胚记为E1代体胚，以此类推)，用制备好的CcKOpro∷GUS启动子表达载体的农杆菌菌液进行侵染，培养至E1、E2、E3代分别进行GUS染色。研究结果发现，GUS染液浸染8h后部分转化体胚呈现明亮的蓝色....

图4核桃CcKOpro∷GUS阳性体胚及再生植株的PCR鉴定

图3核桃CcKOpro∷GUS阳性体胚及再生植株的GUS定位分析2.3山核桃CcKO基因在核桃中的遗传转化及表达分析

本文编号：3932640