TIN2基因突变对人胃黏膜上皮细胞GES-1端粒及染色体的影响

发布时间：2024-03-25 22:40

　　[目的]TIN2是一种端粒保护蛋白,在端粒蛋白复合体中起重要作用,目前已知的研究表明端粒保护蛋白复合体-Shelterin的结构改变,可以引起端粒功能的紊乱,导致一系列疾病的发生。本实验在建立稳定的TIN2基因突变真核载体和空载体的人胃黏膜上皮细胞GES-1基础上,来探讨TIN2基因突变对人胃粘膜上皮GES-1细胞的端粒及染色体影响。[方法]建立稳定的TIN2基因突变真核载体和空载体的人胃黏膜上皮细胞GES-1。通过免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交(PNA-Fish)实验检测TIN2基因突变是否能导致端粒DNA的损伤反应从而引发端粒功能障碍损伤灶(TIF),通过染色体实验检测TIN2基因突变能否导致染色体畸变(环状染色体、染色体端-端融合)。Southern blot实验检测TIN2基因突变对端粒相对长度是否有影响。[结果]1、成功的构建了稳定的TIN2基因突变真核载体和空载体的人胃黏膜上皮细胞GES-1。2、PNA-Fish实验发现空载体组和空白组未出现明显损伤灶,TIN2基因突变真核载体的GES-1细胞组中出现了多于3个的端粒功能障碍损伤灶,其差异具有统计学意义(P<0.05...

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图2.1突变载体图谱

图2.1突变载体图谱（2）酶切TIN2基因1）双酶切反应体系均为40μL40μL的pLV表达载体酶切反应体系如表1所示，反应的条件为37℃，3h。表1pLV表达载体的酶切反应体系containsvolumeApaLIApaLI＋NheI1.0μL1.....

图3.2转染后细胞荧光显微镜观察结果（100倍）

注：第一行为模板序列（NCBI上down下来的TINF2原始CDS序列），第二行为构建的TINF2突变载体上TINF2的测序结果，在690-700之间的C位点突变为T位点。3.2成功构建TIN2基因突变真核载体和空载体的GES-1细胞3.2.1....

图3.3Westernblot检测各组细胞中TIN2基因突变蛋白的表达注：*P＜0.05，vsGES-1,GES-1-pLV

3.2.2TIN2基因突变真核载体和空载体的GES-1细胞中突变TIN2蛋白的表达由于TIN2基因突变蛋白没有合适的特异性的抗体，为此我们在目的基因也就是TINF2的N端插入了一个FLAG标签，标签具有特定的抗原性，能被抗FLAG抗体识别。并且标签很小，不会对目的基....

图3.5染色体的形态（1000倍）

第3章结果注：*P＜0.05，vsGES-1,GES-1-pLV3.4染色体分析在1000倍油镜下观察细胞的染色体形态，记录细胞染色体畸变的数目，每组各100个。如图3.5所示，TIN2基因突变真核载体组出现了染色体畸变，空载体组和正常细胞组均未见明显染色....

本文编号：3938953