G6PD缺陷症的诊断和基因治疗实验研究

发布时间：2024-03-27 19:29

　　目的:G6PD缺陷症是常见的单基因遗传性酶缺陷病,目前尚无根治疗法,大规模人群筛查是目前预防疾病的主要手段,同时寻找新型治疗策略也是世界各国研究的重点。CRISPR/Cas9是一种新型基因编辑技术,具有安全性高、特异性强和精确可靠等优点,是一种极具临床应用价值的新技术。目前,利用CRISPR/Cas9技术治疗假肥大性肌营养不良、地中海贫血、血友病等单基因遗传病已在多个实验室开展。本文对重庆地区儿童进行G6PD酶活性和基因筛查,找出最具临床研究价值的突变位点;利用CRISPR/Cas9技术进行定点修复,为G6PD缺陷症治疗提供新策略。方法:应用多色探针熔解曲线法和G6PD/6PGD定量比值法分别检测G6PD基因突变和酶活性,找出突变频率高且G6PD酶活性低的突变位点。针对此位点设计两对sgRNA,构建PX458-G6PD-sgRNA重组质粒。转染HEK293细胞系后,分别在体内和体外采用T7核酸内切酶Ⅰ法(T7EⅠ)和用cas9蛋白酶法检测每对sgRNA的编辑效率。Sanger测序、G6PD/6PGD比值法、荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测CRISPR/Cas9定点...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1.1：重庆地区G6PD缺乏症基因突变频率

图1.1：重庆地区G6PD缺乏症基因突变频率Figure1.1MutationfrequencyofG6PDdeficiencygeneinChongqing注：2.2G6PD酶活性结果将G6PD基因突变的366名儿童召回采集外周静脉血，用G....

图2.1pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒图谱

13）封闭液：5%（w/v）脱脂牛奶TBST1.5ml脱脂奶粉0.075g主要仪器荧光倒置显微镜OLYMPUS公司流式细胞分选仪BD公司VeritiPCR仪ABI公司凝胶电泳仪BIO-RAD公司ChemiXT4凝胶成像仪Syngene公司pSp....

图2.2：针对1376G>T突变位点设计2对sgRNA

图2.2：针对1376G>T突变位点设计2对sgRNAFigure2.2TwopairsofsgRNAfor1376G>TmutationsiteofG6PDgene

图2.3Sanger测序验证px458载体构建成功Figure2.3SuccessfulConstructionofpx458VectorbySangersequencing

29图2.3Sanger测序验证px458载体构建成功Figure2.3SuccessfulConstructionofpx458VectorbySangersequencing脂质体转染HEK293和电穿孔转染K562EK293容易转染，是个....

本文编号：3940379