虹鳟热应激相关两个新miRNA靶基因验证及功能分析

发布时间：2024-03-30 00:08

　　虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是一种在北方地区广泛养殖的冷水性鱼类,对高温具有低耐受性和高敏感性,随着虹鳟养殖业集约化、规模化的发展,虹鳟在夏季面临的生存考验愈加严峻,很易因热应激造成大面积死亡或减产。课题组前期通过高通量测序研究虹鳟热应激前后(18℃和24℃)差异表达的miRNA时发现,在虹鳟头肾中存在两个未知mi RNA,其在热应激前后差异表达极显著(^**P<0.01),分别暂命名为novel-434和novel-242(novel-434和novel-242均为测序所得novel miRNA数据库中miRNA的排序)。通过miRNA靶基因预测软件mi Randa对其靶基因进行预测分析,发现novel-434和novel-242分别负向调控重要的靶基因HSPA4L和CRT。鉴于此,本研究选择HSPA4L作为novel-434待验证的靶基因,CRT作为novel-242待验证的靶基因,利用双荧光素酶报告基因系统验证其靶标关系,并通过GO注释和KEGG分析其功能和调控机制。具体试验结果及结论如下:1.成功克隆pmirGLO-HSPA4L 3’...

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图2-1novel-434与HSPA4LmRNA3'-UTR结合位点

图2-1novel-434与HSPA4LmRNA3'-UTR结合位点Figure2-1Thebindingsitesofnovel-434withHSPA4LmRNA3'-UTR划线部分为生物信息学预测的miRNA与靶基因3’UTR结合位点....

图2-2novel-242与CRTmRNA3'-UTR结合位点

甘肃农业大学2018届硕士学位论文图2-1novel-434与HSPA4LmRNA3'-UTR结合位点Figure2-1Thebindingsitesofnovel-434withHSPA4LmRNA3'-UTR线部分为生物信息学预测的miRN....

图2-3载体克隆试验原理

22min。12000r/min离心2min，收集DNA溶液（注：洗脱液体积不应小于30μ回收效率）。重复实验步骤（8）。）将洗脱后的DNA产物保存在-20℃冰箱，便于后续实验使用。性化pmirGLO载体与HSPA4L/CRT3'-UTR连接靶基....

图2-4pmirGLO载体多克隆位点Figure2-4MultiplecloningsiteofpmirGLOvector

（9）吸去转染液，加入100μL的DMEM（含10%FBS）培养液，37℃，5%培养，分别在24和48h观察并拍照质粒转染效果图片。.2重组载体转染pmirGLO载体主要用于检测miRNA活性，试验中将miRNA的靶mRNA序列pmirGLO....

本文编号：3941509